局部應用IL－12對小鼠S180實體瘤的抗瘤效應及機制初探

蔣麗娜，楊新玲，劉 華，葛麗平，孫 黎，翟登高

（1．河北北方學院醫(yī)學檢驗學院免疫學教研室，河北 張家口075000；2．河北北方學院醫(yī)學檢驗學院微生物學教研室，河北 張家口075000；3．河北北方學院生命科學研究中心，河北 張家口075000；4．河北北方學院醫(yī)學檢驗學院預防醫(yī)學教研室，河北 張家口075000）

白細胞介素－12（IL－12）是主要由巨噬細胞等抗原提呈細胞產生的異二聚體細胞因子，是免疫調節(jié)網絡中的關鍵調控分子，具有多重抗腫瘤生物活性，不僅對腫瘤有直接的抑制作用，而且可以調節(jié)機體免疫系統使其處于有效發(fā)揮抗腫瘤作用的細胞免疫應答狀態(tài)［1］．該研究對小鼠S180實體瘤模型采用IL－12進行免疫治療，通過T細胞亞群測定、瘤體組織學觀察，從細胞免疫的角度分析IL－12抗腫瘤作用的機制．

1 材料與方法

1．1 材 料

1．1．1 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品．藻紅蛋白 （phycoerythrin，PE）標記的大鼠抗小鼠CD4單克隆抗體、異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的大鼠抗小鼠CD3單克隆抗體、別藻青蛋白 （APC）標記的大鼠抗小鼠CD8單克隆抗體及鼠源重組IL－12試劑購自深圳晶美生物有限公司，其它試劑均為分析純．

1．1．2 動物 6～8周齡Ba LB／c系小鼠，18～20 g，雌性，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供．

1．1．3 細胞株 S180細胞株由河北醫(yī)科大學實驗動物部提供．

1．2 方 法

1．2．1 動物模型的建立 于Ba LB／c小鼠左后肢皮下接種1×107個S180瘤細胞，荷瘤成功后，開始抑瘤實驗．

1．2．2 實驗分組和給藥 將40只荷瘤成功的小鼠隨機分為生理鹽水 （對照組）和0．5 ng／m L IL－12治療組，每組為20只．于荷瘤第7、14、21天每只小鼠瘤旁注射生理鹽水0．2 m L、0．5 ng／m L IL－12 0．2 m L．

1．2．3 抑瘤率和瘤指數的檢測 末次治療一星期后，各組動物同時全部處死，剝離瘤體稱重，計算抑瘤率和瘤指數．

1．2．4 外周血中T淋巴細胞亞群的檢測 將各組小鼠摘取的眼球抗凝血采用直接免疫熒光－流式細胞術，測定外周血中CD3＋T、CD4＋T細胞和CD8＋T細胞的百分率，計算CD4＋／CD8＋比值．

1．2．5 形態(tài)學檢查 將腫瘤組織用10%甲醛進行固定，留作光學顯微鏡觀察形態(tài)學并拍照．

1．2．6 觀察指標 動物的一般情況及腫瘤生長狀況的觀察：每日觀察小鼠的飲食、毛色、活動等一般狀況；開始抑瘤實驗的同時，定期 （每隔3天）用游標卡尺測量腫瘤大小，以0．5× （長＋寬）表示［2］；并每日測量記錄每只小鼠的體重．

1．3 統計學分析

2 結 果

2．1 小鼠的一般情況觀察

自第14日后，生理鹽水組小鼠一般狀況變差，逐漸出現精神萎靡、行動遲緩、毛發(fā)干澀；而同期的IL－12組小鼠一般狀況明顯優(yōu)于生理鹽水組小鼠，精神一直很好，行動比較敏捷，毛發(fā)油亮．

2．2 IL－12對小鼠S180移植腫瘤生長的動態(tài)影響

各組小鼠在接種腫瘤細胞第7天左右開始觸摸到瘤塊，對照組的腫瘤生長速度快．第14天，IL－12組的腫瘤大小達到 （7．56±0．09）mm，此后逐漸縮小，到第27天時，腫瘤大小為 （5．12±1．56）mm，明顯小于生理鹽水組 （15．34±3．18）mm （P＜0．01）（見圖1）．

結果顯示，應用IL－12有顯著的抗腫瘤效果，腫瘤生長受到明顯抑制．實驗過程中發(fā)現有的小鼠腫瘤局部有明顯炎癥反應，瘤組織出現壞死，癌腫向下凹陷，最后腫瘤組織變硬、結痂而脫落，甚至出現腫瘤消退現象．

2．3 各組小鼠抑瘤率和瘤指數的比較

IL－12實驗組的抑瘤率為 （31．85±7．24）%，見表1．

生理鹽水組小鼠瘤指數為 （7．67±0．67），IL－12組的小鼠瘤指數為 （3．95±0．49），明顯低于生理鹽水組 （P＜0．01）（見表1）．

圖1 小鼠S180移植腫瘤生長趨勢

表1 各組荷瘤小鼠的瘤指數和抑瘤率的變化比較

2．4 荷瘤小鼠外周血中T細胞亞群的變化

從表2、圖 （2、3）可見，不論是生理鹽水組還是IL－12組的小鼠外周血中CD3＋、CD4＋、CD8＋T細胞均低于正常小鼠，說明小鼠荷瘤后機體的免疫功能均下降．采用IL－12治療后，上述指標均高于生理鹽水組 （P＜0．05），CD4＋／CD8＋比值也上升，說明通過治療，荷瘤小鼠的免疫功能得到改善．

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細胞亞群百分率表達的比較 ±s）

表2 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T細胞亞群百分率表達的比較 ±s）

注：＊與生理鹽水組相比P＜0．05

組別 n CD3＋ CD4＋ CD8＋ CD4＋／CD8＋正常小鼠 10 68．00±7．07 45．70±5．50 25．00±2．97 1．82±0．2．73±0．30 18生理鹽水組 20 40．86±4．20 28．68±4．13 11．96±1．02 2．41±0．42 IL－12組 20 55．12±6．63＊ 39．65±5．08＊ 14．53±1．73＊

圖2 流式細胞儀分析T細胞亞群結果 （對照組）

圖3 流式細胞儀分析T細胞亞群結果 （IL－12組）

2．5 腫瘤細胞的形態(tài)學觀察

2．5．1 生理鹽水組小鼠腫瘤細胞形態(tài)學觀察：腫瘤細胞密集成團，大小不等，核仁大、明顯，核內異染色質少，胞質深淺不等 （見圖4）．

圖4 生理鹽水組小鼠腫瘤細胞形態(tài)學觀察 （HE×400，↑腫瘤細胞）

2．5．2 IL－12組小鼠腫瘤細胞觀察：核固縮，細胞碎片多，出現大片壞死，但淋巴細胞和巨噬細胞少見（見圖5）．

圖5 IL－12組小鼠腫瘤細胞形態(tài)學觀察 （HE×400，↑細胞壞死）

3 討 論

在眾多刺激對抗腫瘤抗原的有效免疫應答的策略中，用適當的免疫佐劑加強抗原的免疫原性是其中之一．最近，IL－12已被確定為多種傳染病疫苗接種模型的強有力佐劑．無論局部或全身給予IL－12或IL－12基因轉導細胞疫苗，在動物的腫瘤疫苗研究中均獲得可喜成果．以人類為研究對象的實驗數據清楚地表明，IL－12能夠增強腫瘤特異性細胞反應［3］．

IL－12抗腫瘤效應涉及固有免疫和適應性免疫效應機理．IL－12誘導的IFN－γ和其它二級、三級前炎癥細胞因子級聯效應對腫瘤細胞有直接毒性作用，或者可以激活有效的抗血管生成機制［4］．在本次研究中，采用鼠源重組IL－12瘤旁皮下注射，觀察其對荷瘤小鼠的治療效果．結果顯示，IL－12具有良好的抗腫瘤效果，能誘導荷瘤小鼠體內明顯的免疫應答．

Kanagawa等研究表明，在IL－12無效的小鼠Meth－A腫瘤模型局部注射IL－12能夠引起對腫瘤細胞的局部和系統免疫應答，并誘導機體免疫應答和改變腫瘤微環(huán)境的協調效應，而改變腫瘤微環(huán)境可以增強淋巴細胞浸潤，導致抗腫瘤效應［5］．本實驗結果顯示，荷瘤小鼠外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細胞所占百分比均顯著低于正常小鼠 （P＜0．01），說明荷瘤小鼠不論是治療組還是生理鹽水組其機體免疫功能低于正常小鼠．采用IL－12進行免疫治療后，外周血中CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T細胞所占百分比均較生理鹽水組有顯著提高 （P＜0．05），提示IL－12治療對惡性腫瘤小鼠體內的細胞免疫能力有恢復作用，使機體的免疫功能有明顯的改善．一般認為，CD8＋T細胞在殺傷腫瘤細胞中起主要作用，CD4＋T細胞在腫瘤免疫中起重要的輔助作用，而CD4＋／CD8＋的比值的大小直接反映出機體細胞免疫的功能強弱［6，7］．本實驗發(fā)現IL－12治療組的CD4＋／CD8＋的比值高于生理鹽水組 （P＜0．01），這提示小鼠的機體可能通過增強細胞免疫功能來實現抗腫瘤的．體內和體外研究揭示，IL－12能夠快速改變腫瘤相關巨噬細胞和腫瘤浸潤巨噬細胞的功能［8］．本實驗發(fā)現，生理鹽水組的腫瘤組織，腫瘤細胞密集成團，核仁大、明顯，大小不一，具有核分裂像；IL－12治療小鼠的腫瘤組織中可見大片腫瘤細胞壞死，但很少見到炎性細胞，但可見到核固縮、核碎裂和許多細胞碎片，提示IL－12可能通過誘導細胞凋亡來實現抗腫瘤的作用．

本實驗結果表明IL－12在體內具有良好的抗腫瘤作用，經其治療后，細胞免疫方面的指標 （CD3＋T、CD4＋T、CD8＋T、CD4＋／CD8＋）均得到明顯改善，提高了細胞免疫功能，因此認為IL－12的抗腫瘤作用主要是通過調節(jié)機體免疫功能來實現的．Cao等研究揭示IFN－γ信號轉導直接引起Treg細胞周期停滯，IL－12——IFN－γ軸能夠抑制腫瘤誘導的Treg細胞增殖，這一機制可以抵消體內Treg細胞促進腫瘤生長的能力［9］．我們課題組將通過進一步檢測Treg細胞及血清中IFN－γ、IL－2等深入研究IL－12的抗腫瘤機制．

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