壩上油菜蜂花粉中多糖和乙醇提取物對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究

梁巖冰，許麗娟，王治寶

（1．張家口市食品藥品監(jiān)督管理局人事培訓(xùn)科，河北 張家口075000；2．張家口第四醫(yī)院藥劑科，河北 張家口075000；3．河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 張家口075000）

N－亞硝基化合物是目前所知的最強(qiáng)的化學(xué)致癌物之一，能引起人和動(dòng)物的胃、肝臟等多種器官的惡性腫瘤．亞硝酸鹽是N－亞硝基化合物的合成前體．尤其是在人和動(dòng)物的胃內(nèi)，特別適于N－亞硝基化合物的合成［1］．因此清除亞硝酸鹽是阻斷致癌物的產(chǎn)生、防治癌變的有效措施之一．

蜂花粉 （bee pollen）中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類(lèi)、黃酮、各種活性酶、激素、維生素和礦物質(zhì)等，不僅是一種天然的完全營(yíng)養(yǎng)型的滋補(bǔ)品，而且還是治療各種疾病的名貴藥材［2］．本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取油菜蜂花粉中多糖，采用超聲法制備油菜蜂花粉乙醇提取液，然后在體外模擬胃液條件下，研究油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物清除亞硝酸鹽的作用．

1 儀器與藥品

儀器：HITACHI U－3900紫外分光光度計(jì) （天美科技有限公司）；GOA－型電熱真空干燥箱 （天津東郊機(jī)械加工廠）；DL－720超聲波儀 （寧波江南儀器廠，45 KHz±5%）．

藥品：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供，油菜蜂花粉為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，于硅膠干燥器中干燥兩天后備用，其余試劑均為分析純．

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2．1 油菜蜂花粉中黃酮和多糖的含量測(cè)定

2．1．1 乙醇提取物的制備

稱(chēng)取油菜蜂花粉20．00 g，以95%乙醇為溶劑微波處理30 s［3，4］．浸泡24 h后，于70℃超聲提取3次，每次25 min，料液比依次為1∶10、1∶15、1∶20，合并濾液，濾渣留待提取多糖．濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，移至培養(yǎng)皿中烘干，稱(chēng)重待用．

2．1．2 蜂花粉總黃酮的含量測(cè)定

精密稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0．015 0 mg，置于25 ml容量瓶中，加7．5 ml無(wú)水乙醇完全溶解后，加三蒸水定容至刻度，搖勻后作為儲(chǔ)備液．準(zhǔn)確量取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0．25 ml，0．50 ml，0．75 ml，1．00 ml，1．25 ml，1．50 ml于6只10 ml容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉0．30 ml，搖勻，放置6 min后加入10%硝酸鋁0．30 ml，搖勻，放置6 min后加入4%氫氧化鈉4．00 ml，混勻，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置12 min后以試劑作空白，于510 nm處測(cè)其吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：C＝0．1002 A＋0．0016，r＝0．999 8．結(jié)果表明在濃度為0．01 mg／ml～0．09 mg／ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得油菜蜂花粉總黃酮含量．按下式計(jì)算總黃酮得率．結(jié)果總黃酮的含量以蘆丁記為2．43%，RSD＝1．78%．

2．1．3 蜂花粉多糖的提取

利用水提醇沉法提取花粉多糖［5］．稱(chēng)取上述濾渣，加8倍量蒸餾水，微沸煎煮1 h，過(guò)濾，殘?jiān)?倍量蒸餾水煎煮1 h．合并濾液，加無(wú)水乙醇至醇含量達(dá)80%，靜置過(guò)夜，抽濾，依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，得灰白色粗多糖，于真空干燥器中干燥后稱(chēng)重，待用．

2．1．4 蜂花粉多糖的含量測(cè)定

精密稱(chēng)取葡萄糖對(duì)照品100．4 mg，置100 m L的容量瓶中，加水溶解定容，搖勻，即葡萄糖貯備液．精確吸取葡萄糖貯備液適量，分別加水稀釋制成0．02 mg／ml、0．04 mg／ml、0．06 mg／ml、0．08 mg／ml、0．10 mg／ml、0．12 mg／ml的溶液，搖勻．分別精確吸取上述不同濃度溶液1．0 m L，置錐形瓶中，均加10%苯酚溶液1 m L，搖勻，迅速加入濃硫酸5．0 m L，立即搖勻，室溫放置30 min，平行空白，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線．得回歸方程C＝0．0174 A＋0．0002，r＝0．9997．結(jié)果表明在濃度為0．005～0．03 mg／ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得油菜蜂花粉多糖含量．按下式計(jì)算總多糖得率．多糖含量 （%）＝C×D×100／W．結(jié)果花粉多糖含量以葡萄糖記為10．79%，RSD＝5．52%．

2．2 油菜蜂花粉乙醇提取物和花粉多糖對(duì)亞硝酸鹽清除作用的研究［6］

分別吸取油菜蜂花粉多糖貯備液或乙醇提取物貯備液0．00、1．00、3．00、5．00、7．00 ml于50．00 ml容量瓶中，加入25．00 ml p H3．0的檸檬酸鈉－鹽酸緩沖液，再加入100 mg／ml的Na NO2溶液5．00 ml，用蒸餾水定容．在體外模擬胃液，37℃下恒溫1h后吸取1．00 ml反應(yīng)液于7 cm2的培養(yǎng)皿中，加入0．4%的對(duì)氨基苯磺酸溶液2．00 ml，0．1%α－萘胺溶液2．00 ml，搖勻，放置15 min后，于525 nm處測(cè)吸光度值 （Ax），同時(shí)用蒸餾水做空白實(shí)驗(yàn) （A0），則亞硝酸鹽的清除率為：清除率＝（A0－Ax）／A0×100%．

結(jié)果表明清除率大小隨多糖和乙醇提取物的濃度變化而變化．花粉乙醇提取物加樣濃度為2．333 mg／ml時(shí)對(duì)亞硝酸鈉的清除率最大，清除率為25．37%，見(jiàn)圖1．花粉多糖在加樣濃度為4．317 mg／ml時(shí)對(duì)亞硝酸鈉的清除作用最大，清除率為41．70%．見(jiàn)圖2．

圖1 乙醇提取物對(duì)亞硝酸鈉的清除作用

圖2 多糖對(duì)亞硝酸鈉的清除作用

3 討 論

采用微波對(duì)花粉進(jìn)行破壁處理后，其內(nèi)含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可得以充分釋放，各種活性成分的提取分離相對(duì)容易．微波萃取具有設(shè)備簡(jiǎn)單、適用范圍廣、萃取效率高、重現(xiàn)性好、節(jié)省時(shí)間、節(jié)省試劑、污染小等特點(diǎn)．

亞硝酸鹽在弱酸性條件下，與氨基苯磺酸重氮化后，再與α－萘胺偶合生成紅色的化合物，用分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽的含量．同樣條件下加入樣品液，樣品對(duì)亞硝酸鹽清除以后，再用上述方法測(cè)定剩余的亞硝酸鹽含量，進(jìn)而可計(jì)算出被清除的亞硝酸鹽的量．

結(jié)果表明壩上油菜蜂花粉多糖和乙醇提取物對(duì)亞硝酸鹽均有一定清除作用．其中多糖清除亞硝酸鹽的作用接近山楂和洋蔥提取物對(duì)亞硝酸鹽的清除作用［6，7］．

［1］ 宋茹，偉榮．微波法浸提桔皮類(lèi)黃酮及其對(duì)NO2－清除作業(yè)的研究 ［J］．食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28 （07）：25－28

［2］ 郭奕明．花粉與營(yíng)養(yǎng)保健 ［J］．植物雜志，2002，（06）：39－40

［3］ 盧挺．青藏高原油菜蜂花粉酶解破壁研究 ［J］．食品科學(xué)，2002，23（03）：126－127

［4］ 楊志巖，尹樹(shù)花．油菜花粉中總黃酮的提取研究 ［J］．現(xiàn)代食品科技，2007，24（02）：164－166

［5］ 楊輝，趙媛．苯酚－硫酸法測(cè)定桃葉鴉蔥根中多糖的含量 ［J］．河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，27（05）：19－21

［6］ 趙二勞，王曉妮，張海容，等．山楂清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究 ［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（10）：29－31

［7］ 郭艷華，張玉敏．洋蔥提取物清除亞硝酸鹽的研究 ［J］．化學(xué)研究與應(yīng)用．2008，20（08）：1084－1086