鮑曼不動桿菌整合酶基因測定及可變區(qū)基因盒結(jié)構(gòu)分析*

馬全玲 武大偉 魏殿軍 張堅磊 胡靜儀

整合子（integron）是上世紀(jì)80年代在對耐藥質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子進(jìn)行系統(tǒng)研究的過程中被發(fā)現(xiàn)的。常見的耐藥整合子分為5類，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類相關(guān)研究較多。整合子本身無法進(jìn)行轉(zhuǎn)移，但常常出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子及接合性質(zhì)粒上，這種情況提高了耐藥基因盒擴(kuò)散的能力[1]。本研究通過設(shè)計Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因的特異性引物，采用PCR和DNA序列分析方法測定本地區(qū)鮑曼不動桿菌整合子存在的狀況及類型，結(jié)合已檢測的耐藥基因，應(yīng)用多基因聚類分析的方法對臨床分離株進(jìn)行親緣性分析，以了解其在天津地區(qū)的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料 2008年2月—2009年2月收集分離自天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院及天津市環(huán)湖醫(yī)院的多重耐藥鮑曼不動桿菌共55株。采用K-B法測定14種抗菌藥物的敏感性，判定標(biāo)準(zhǔn)按照美國臨床實驗室國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）2007年的標(biāo)準(zhǔn)。醫(yī)院內(nèi)感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部2001年《醫(yī)院感染管理規(guī)范》診斷標(biāo)準(zhǔn)，對3種及3種以上不同種類抗菌藥物耐藥的菌株判定為多重耐藥株。標(biāo)準(zhǔn)菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2 模板DNA的提取 按文獻(xiàn)[2]操作。整合酶基因及可變區(qū)引物的合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，各種靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長度，見表1。

表1 整合酶基因及可變區(qū)引物序列

1.3 整合酶基因及整合子可變區(qū)的PCR擴(kuò)增 （1）整合酶基因的PCR擴(kuò)增：對55株多重耐藥株分別進(jìn)行Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因的PCR擴(kuò)增。Ⅰ類和Ⅱ類、Ⅲ類整合酶基因檢測的反應(yīng)條件相同，參照參考文獻(xiàn)[3]。（2）整合酶基因陽性株整合子可變區(qū)的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）-PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系（50 μL）為One shot LA PCRTMMix 25 μL，上下游引物（25 pmol）各1 μL,模板DNA 3 μL，剩余體積用滅菌去離子水補(bǔ)足，94℃5 min,94℃45 s,47℃45 s,72℃1 min,72℃10 min，進(jìn)行35次循環(huán)。對可變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HinfⅠ進(jìn)行RFLP分型。

1.4 觀察指標(biāo) PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用紫外透射儀進(jìn)行初步分析，陽性結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)拍照。把整合子可變區(qū)擴(kuò)增片段大小相同且RFLP顯示同一帶型的可變區(qū)片段認(rèn)為具有相同的DNA序列[4]。PCR產(chǎn)物的純化、克隆均按試劑盒說明操作后，將連有目的基因的重組質(zhì)粒送往上海英駿公司進(jìn)行正反向測序，在GenBank上進(jìn)行BLAST分析后確定可變區(qū)含有的基因盒類型。

1.5 多基因聚類分析菌株間親緣性（Average法） 參照參考文獻(xiàn)[5]，用1來代表特異性基因擴(kuò)增的片段條帶存在，用0來代表特異性基因擴(kuò)增的片段條帶不存在，把55株多重耐藥鮑曼不動桿菌已檢測過的各種基因檢測數(shù)據(jù)收集起來組成一個原始數(shù)據(jù)矩陣，采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行聚類分析以獲得菌株間親緣性分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 整合酶基因和可變區(qū)的檢測 55株多重耐藥鮑曼不動桿菌共檢出47株含有Ⅰ類整合酶基因,在所入選的藥物中，整合酶基因陽性株耐藥率明顯高于整合酶基因陰性株,見表1。其中47株Ⅰ類整合酶基因陽性株中有23株檢出可變區(qū)結(jié)構(gòu)，未檢出Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因，可變區(qū)的PCR產(chǎn)物共有2個片段長度：1 500 bp（4株）和2 000 bp（19株）,見圖1、2。對其用HinfⅠ進(jìn)行酶切后，發(fā)現(xiàn)1 500 bp可變區(qū)RFLP顯示同一帶型；2 000 bp可變區(qū)RFLP也顯示同一帶型，見圖3、4。

表2 Ⅰ類整合子陽性株與陰性株耐藥率比較 株（%）

圖1 1 500 bp可變區(qū)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 1 500 bp可變區(qū)RFLP電泳結(jié)果

圖2 2 000 bp可變區(qū)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖4 2 000 bp可變區(qū)RFLP電泳結(jié)果

2.2 可變區(qū)PCR產(chǎn)物測序 BLSAT網(wǎng)上比對分析結(jié)果顯示，1 500 bp可變區(qū)含有arr-3和aacA4 2個基因盒；2 000 bp可變區(qū)含有aacA4、catB8及aadA1 3個基因盒。

2.3 多基因聚類分析菌株間親緣性 見圖5。55株多重耐藥鮑曼不動桿菌中主要存在3種克隆株，Ⅰ：53、54、1、45、50、37、41、9及36號菌株均攜帶TEM、ADC、intⅠ1基因;Ⅱ：18、20、7、10及12號菌株均攜帶ADC基因;Ⅲ：48、51、2、34、35、31、32、25、27、23、14、21、22、17、19、15、16、13、14、8、11、4及6號菌株均攜帶ADC和intⅠ1基因，39、40、38號菌株攜帶TEM、ADC、intⅠ1、OXA-23及IMP-2基因，30、46、26號菌株攜帶intⅠ1基因，33、43、5號菌株未發(fā)現(xiàn)攜帶本實驗所研究的基因。其中，Ⅰ和Ⅱ組有交叉均含有ADC基因，Ⅰ和Ⅲ也有交叉均含有intⅠ1基因等，它們之間具有親緣關(guān)系。

3 討論

整合子由1個編碼整合酶的intⅠ基因、2個基因重組位點attI和attC、啟動子和基因盒構(gòu)成，目前已知的2組整合子包括:耐藥整合子（resistant-integrons, RI）和超級整合子（super-integrons,SI）。耐藥整合子位于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒及染色體，幾乎所有編碼抗微生物耐藥的耐藥基因均來自耐藥整合子。根據(jù)整合酶基因序列不同，耐藥整合子可分為5類，Ⅰ類整合子主要存在于Tn21及與Tn21類似轉(zhuǎn)座子上，Ⅱ類整合子常與Tn7相關(guān)，Ⅲ類整合子僅在少數(shù)腸桿菌科如沙雷氏菌中可檢出。有報道Ⅳ、Ⅴ類整合子在其他菌中存在[1]。本研究結(jié)果顯示，47株鮑曼不動桿菌Ⅰ類整合酶基因擴(kuò)增陽性，陽性率為85.5%（47/55），未測到Ⅱ、Ⅲ類整合酶基因，與Hall等[6]報道在不動桿菌中Ⅰ類整合子最常見相符。

整合子可變區(qū)基因盒由耐藥基因和attC(59 bp)組成，在整合子中已發(fā)現(xiàn)100多種基因盒[7]，編碼的耐藥基因覆蓋了大多數(shù)目前正在使用的抗菌藥物。本研究對整合酶基因陽性株進(jìn)行可變區(qū)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示有23株可變區(qū)陽性，共檢測出2種Ⅰ類整合子系統(tǒng)，片段長度為1 500 bp和2 000 bp。其中4株出現(xiàn)1 500 bp條帶，測序結(jié)果為arr-3，aacA4；19株出現(xiàn)2 000 bp條帶，測序結(jié)果為aacA4，catB8，aa?dA1，它們分別是氨基糖苷類、氯霉素、利福平類耐藥的基因，其中aacA4，catB8，aadA1這一基因盒組合在國內(nèi)外均有報道[8]。另外，本研究中整合子可變區(qū)并未檢測出磺胺類耐藥基因，但藥敏結(jié)果卻顯示整合子與該類抗生素耐藥的有關(guān)，考慮原因可能是由于整合子陽性菌對磺胺類藥物的耐藥還有另外的影響因素，即在Ⅰ類整合子的3′保守區(qū)含有一個磺胺類耐藥基（sul1），故攜帶Ⅰ類整合子的菌株就可介導(dǎo)對磺胺類抗菌藥物的耐藥。

本研究中未發(fā)現(xiàn)喹諾酮類抗菌藥物的耐藥基因位于整合子可變區(qū)中，但藥敏表型上整合子陽性株耐藥率比陰性株耐藥率顯著增高，可能是與細(xì)菌染色體DNA的基因突變有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，同一類耐藥基因aacA4可在不同菌株間檢出，表明在藥物持續(xù)選擇壓力下，不僅耐藥基因盒上耐藥基因本身發(fā)生變異，也促使整合子整合其他耐藥基因，耐藥基因盒在不同菌株間移動，造成細(xì)菌耐藥性的變化，甚至造成多重耐藥。此前筆者曾預(yù)測整合子上存在OXA-23或IMP-1、IMP-2基因，但結(jié)果顯示該類基因未處于整合子上，考慮正是這2類基因未能快速大范圍擴(kuò)散的原因。

本研究結(jié)果顯示，整合子可變區(qū)的PCR擴(kuò)增陽性率（23/55，41.8%）沒有整合酶基因PCR擴(kuò)增陽性率高（47/55，85.5%），有24株未能擴(kuò)增出可變區(qū)結(jié)構(gòu)，與國外相關(guān)研究報道相似[9]，可能原因是基因盒片段過長不能有效擴(kuò)增，常規(guī)PCR擴(kuò)增有效的產(chǎn)物大小應(yīng)在2～3 kb以內(nèi)，而有些整合子可變區(qū)含多個耐藥基因盒超過有效擴(kuò)增范圍，且若一株菌內(nèi)同時存在2個以上大小片段不等的整合子結(jié)構(gòu)，則PCR擴(kuò)增時可能僅擴(kuò)出小片段整合子;另外，若整合子3-CS引物相應(yīng)序列缺失造成無法擴(kuò)增，也可造成假陰性結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，攜帶3種基因、攜帶1種基因及攜帶2種基因的3種鮑曼不動桿菌為流行株（3個克隆），它們均攜帶intⅠ1基因，提示intⅠ1可與其他耐藥基因同時存在一個流行株中；另外，這些菌株均已被公認(rèn)為院內(nèi)感染菌株，亦提示本研究中流行株的出現(xiàn)是由于院內(nèi)感染所致。同時，每個克隆所含菌株耐藥表型不盡相同，且它們分離自不同醫(yī)院，表明克隆株在醫(yī)院間存在交叉?zhèn)鞑?，需要臨床醫(yī)生和微生物工作者給予足夠重視。

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