甘草不定根培養(yǎng)的研究*

張 堅(jiān) ，高文遠(yuǎn) ，，4，王 娟 ，呂連媛

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；4.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

甘草不定根培養(yǎng)的研究*

張 堅(jiān)1，2，高文遠(yuǎn)1，2，3，4，王 娟3，呂連媛2，4

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193；2.天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；
3.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；4.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

[目的]考察甘草不同外植體與外源性激素誘導(dǎo)不定根能力，為甘草不定根培養(yǎng)做基礎(chǔ)研究。[方法]切取烏拉爾甘草無菌實(shí)生苗的根、葉、帶芽莖段接種到含有不同外源性激素的不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，考察不同外植體誘導(dǎo)生根的能力，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不定根增殖嘗試。[結(jié)果]不同外植體以及不同類型和濃度的外源性生長素對不定根誘導(dǎo)能力不同。根和葉誘導(dǎo)不定根效果好于帶芽莖段；萘乙酸（NAA）較吲哚丁酸（IBA）更有利于不定根的誘導(dǎo)，6-芐氨基嘌呤（BA）則抑制不定根的誘導(dǎo)；不同類型的外植體誘導(dǎo)生根的生長素（NAA）適宜濃度存在差異，其中根段在0.2～1 mg/L，真葉在3～5 mg/L，帶芽莖段在1～3 mg/L誘導(dǎo)效果較好。[結(jié)論]甘草不同外植體在含有外源性生長素的培養(yǎng)基中均可以誘導(dǎo)生根，但細(xì)胞分裂素強(qiáng)烈的抑制生根；根段和真葉作為外植體是甘草不定根誘導(dǎo)較為理想的材料。

甘草；不同外植體；外源性激素；不定根

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch.G.Glabra L.）為甘草正品，別名甜草、蜜草，為豆科甘草屬多年生草本植物，是荒漠半荒漠地區(qū)重要的固沙植物，同時(shí)也是接近瀕危的大宗道地藥材，此外甘草還廣泛用于食品、飲料、卷煙業(yè)和化妝品工業(yè)，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]。由于中國野生甘草遭到無計(jì)劃的毀滅性采挖，導(dǎo)致野生甘草資源日趨枯竭，

甚至面臨滅絕危險(xiǎn)[2]。目前，中國甘草資源主要是通過傳統(tǒng)人工栽培方式獲得。在甘草組織培養(yǎng)方面，有關(guān)于甘草組培苗快繁的報(bào)道[3]以及甘草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的研究[4]，但還沒有關(guān)于甘草不定根培養(yǎng)的研究報(bào)道。本研究通過不定根培養(yǎng)的方式直接獲得甘草不定根，為甘草藥材資源更新進(jìn)行新的嘗試。

1 材料與方法

1.1 材料 烏拉爾甘草種子購自北京時(shí)珍中草藥技術(shù)（集團(tuán)）有限公司

1.2 方法

1.2.1 甘草無菌苗的獲得 取烏拉爾甘草種子 [已用濃硫酸（H2SO4）處理]，流水沖洗 1 h，將種子放入超凈臺(tái)上，70%的乙醇中浸30 s，用無菌水沖洗2～3次，再用4%次次氯酸鈉（NaClO）浸泡 20 min，無菌水沖洗5次，吸干材料表面水分后接種到無激素的MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度 2 500～3 000 lx，蔗糖 30 g/L，初始pH 6.0。3～5 d左右甘草種胚萌動(dòng)，培養(yǎng)20 d左右胚芽可長高6～8 cm，每株含3～4片真葉。

1.2.2 外植體在含不同外源性生長素以及在同時(shí)添加細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根 切取無菌苗中真葉、帶芽莖段、根為考察外植體，分別接入到含萘乙酸（NAA）或吲哚丁酸（IBA）1 mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，觀察不同類型外植體在不同外源性生長素條件下的生根情況。此外，為了考察細(xì)胞分裂素對外植體生根的影響，實(shí)驗(yàn)中在添加生長素NAA同時(shí)，還分別添加0.2 mg/L的細(xì)胞分裂素[6-芐氨基嘌呤（BA）或激動(dòng)素（KT）]。外植體中根和帶芽莖段均切成1 cm左右的切段，平放于培養(yǎng)基中；真葉選擇1 cm2左右，帶部分葉柄，在葉片上橫向切2～3刀至中脈，背面朝下緊貼培養(yǎng)基中。培養(yǎng)溫度（25±1）℃，暗培養(yǎng)，蔗糖30 g/L，初始pH 6.0。每個(gè)處理30個(gè)外植體，重復(fù)2次。

1.2.3 外植體在含不同濃度的生長素NAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根 切取無菌苗中真葉、帶芽莖段、根為考察外植體，分別接入到含 NAA0.2、0.5、1、3、5 mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，觀察不同類型外植體在不同濃度的NAA條件下誘導(dǎo)生根的情況。外植體的處理同1.2.2，培養(yǎng)條件除外源性激素外同1.2.2。每個(gè)處理30個(gè)外植體，重復(fù)2次。

1.2.4 不定根繼代增殖 將由根段和真葉誘導(dǎo)所獲得的不定根進(jìn)行繼代增殖，培養(yǎng)條件為1/2MS+NAA1 mg/L，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，暗培養(yǎng)，蔗糖 30 g/L，初始pH 6.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體與不同類型外源性激素 不同類型的外植體在含有外源性生長素NAA或IBA的培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)出不定根（見表1，圖1～3）。一般在12 d左右可以用肉眼看到外植體表面產(chǎn)生白色不定根，但不同外植體在不同外源生長素誘導(dǎo)下不定根的誘導(dǎo)和生長存在明顯差異。NAA更有利于不定根的誘導(dǎo)，不同外植體在NAA誘導(dǎo)下生根率均超過50%，且比相應(yīng)IBA誘導(dǎo)的生根率和生根數(shù)明顯要高，但從不定根的生長情況看，IBA似乎更有利于不定根的生長，尤其是帶芽莖段和真葉。此外，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)向培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素（BA和KT）后，外植體表面僅出現(xiàn)愈傷組織，但無不定根發(fā)生，這說明細(xì)胞分裂素抑制了甘草不定根的發(fā)生。

表1 不同外植體在添加不同外源生長素（1 mg/L）或兼有細(xì)胞分裂素（0.2 mg/L）的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)下生根情況Tab.1 Rooting situation of different explants in the mediumwith different auxin(1 mg/L)or having cytokinin(0.2 mg/L)

2.2 外植體與不同濃度的NAA 生長素作為植物重要的生理活性物質(zhì)，不僅有利于外植體生根，同時(shí)也有利于外植體愈傷化。實(shí)驗(yàn)中，隨著外源生長素NAA濃度的提高，外植體愈傷化程度不斷增強(qiáng)，但誘導(dǎo)生根的效果卻存在明顯的差異（見表2）?？梢钥闯觯庵搀w根段僅在低濃度NAA（0.2～1 mg/L）時(shí)誘導(dǎo)生根效果較好，隨著NAA濃度的增加，愈傷化逐漸增強(qiáng)，其不定根誘導(dǎo)能力明顯減弱，當(dāng)NAA濃度增加到5 mg/L時(shí)，外植體完全喪失生根能力；真葉則和根段誘導(dǎo)效果相反，當(dāng)NAA濃度較低時(shí)，真葉誘導(dǎo)生根能力較差，隨著NAA濃度的增加，愈傷化加強(qiáng)，其不定根誘導(dǎo)能力也隨之加強(qiáng)，當(dāng)NAA濃度增加到3 mg/L時(shí)，生根效果最好，進(jìn)一步增加NAA濃度，發(fā)現(xiàn)雖然生根率和生根數(shù)很高，但不定根生長緩慢。帶芽莖段生根特點(diǎn)接近于根段。從上面分析，可以推測不同類型的外植體誘導(dǎo)生根的機(jī)制可能存在差異。外植體根段最有可能是直接誘導(dǎo)生根，故當(dāng)NAA濃度增加時(shí)，根段表面愈傷組織的產(chǎn)生會(huì)抑制外植體中根原基的產(chǎn)生，故在NAA升高到5 mg/L時(shí)，沒有生根；而真葉可能更多的是通過愈傷組織的分化而實(shí)現(xiàn)不定根的誘導(dǎo)，雖然在低濃度時(shí)，真葉切口處亦可直接產(chǎn)生不定根，但不定根的誘導(dǎo)率和平均不定根數(shù)目很低，而增加NAA濃度后，真葉表面愈傷組織增加的結(jié)果使得不定根的誘導(dǎo)率和不定根數(shù)呈現(xiàn)明顯上升的趨勢，當(dāng)NAA濃度升高到5 mg/L時(shí)，愈傷組織表面出現(xiàn)大量短小的不定根，這說明真葉主要是通過愈傷組織的分化間接誘導(dǎo)不定根，而在外植體表面直接誘導(dǎo)不定根效果較差。帶芽莖段誘導(dǎo)生根的機(jī)制似乎接近于外植體根段，及當(dāng)NAA處于低濃度時(shí)，外植體表面直接誘導(dǎo)不定根發(fā)生，NAA濃度增加則愈傷化程度增加，影響其生根能力。

2.3 繼代增殖 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)選擇帶有少量愈傷組織的不定根進(jìn)行繼代培養(yǎng)效果優(yōu)于缺乏愈傷組織的不定根，但不定根在繼代時(shí)的生長速度仍不令人滿意（見圖4），其原因可能和外源性生長素有關(guān)，即單獨(dú)使用NAA雖然有利于甘草外植體誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生，但可能不利于不定根的生長，故如何使誘導(dǎo)出?的不定根在繼代增殖過程中既保持較強(qiáng)的不定根誘導(dǎo)能力，又可讓不定根獲得較好的生長速度將是下一步重點(diǎn)考察的問題。筆者將對外源性生長素NAA和IBA的激素組合進(jìn)行考察，希望能找到既有利于不定根誘導(dǎo)增殖又有利于不定根生長的培養(yǎng)條件。

圖1 真葉誘導(dǎo)不定根Fig.1 Inducing adventitiousroots with leaves

圖2 帶芽莖段誘導(dǎo)不定Fig.2 Inducing adventitiousroots with stems with buds

圖3 根段誘導(dǎo)不定根Fig.3 Induce adventitiousroots with roots

圖4 不定根繼代增殖Fig.4 Secondary cultureof adventitious roots

表2 不同外植體在不同濃度的NAA誘導(dǎo)下生根情況Tab.2 Rooting situation of different explant in the differentconcentration of NAA

3 結(jié)論

甘草根、莖、葉均可在一定條件下誘導(dǎo)生根，但不同外植體在外源性生長素誘導(dǎo)下不定根的分化能力和生長明顯不同，表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。其中根和葉的誘導(dǎo)效果較好，帶芽莖段明顯弱于前兩者。生長素中NAA更有利于誘導(dǎo)甘草外植體生根，細(xì)胞分裂素則抑制生根。

NAA在0.2～1 mg/L有利于外植體根段誘導(dǎo)不定根；NAA在1～3 mg/L有利于莖段誘導(dǎo)不定根；NAA 3～5 mg/L有利于真葉誘導(dǎo)不定根。

[1] 張 繼,姚 健,丁 蘭,等.甘草的利用研究進(jìn)展[J].草原與草坪,2000,20(2):12-17.

[2] 王照蘭,杜建材,于林清,等.甘草的利用價(jià)值、研究現(xiàn)狀及存在的問題[J].中國草地，2002,24(1):73-76.

[3] 范小峰,楊穎麗,郭曉強(qiáng),等.烏拉爾甘草不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及影響因子研究[J].中藥材，2009,32(2):173-176.

[4] 卞愛華,高文遠(yuǎn),王 娟.不同誘導(dǎo)子對甘草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中甘草酸積累的影響[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43(22).1690-1693.

[5] 陳 巍,于泉林,高文遠(yuǎn),等.甘草愈傷組織培養(yǎng)的研究[J].中國中藥雜志，2005,30(9):713-715.

Studies on culture of adventitious roots of liquorice

ZHANG Jian1，2，GAO Wen-yuan1，2，3，4，WANG Juan3，et al
（1.School of Traditional Chinese Materia Medica ，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine， Tianjin 300193， China； 2.Key> laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China; 3.School of Pharmaceutical Science and Technology， Tianjin University， Tianjin 300072， China； 4.College of Bioengineering， TianjinUniversity of Science and Technology， Tianjin 300457， China）

[Objective]To study the ability of inducing adventitious roots of different explants and exogenous hormones in order to provide the fundamental researches for the culture of adventitious roots of liquorice.[Method]Cut the roots,leaves and stems with buds of sterile seeds and inoculate them to the induction medium with different exogenous hormones.Inspect the rooting abilities of different explants and try to propagate the roots on this basis.[Result]Different explants and different types and concentrations of exogenous auxins have different inducing ability to adventitious roots.Roots and leaves’effects of inducing adventitious roots are better than that of stem with bud.NAA is better in favor of inducing adventitious roots than IBA.However,BA restraints the inducement of adventitious roots.Different types of explants have different fitting concentrations of auxin(NAA)in inducing roots.The preferable inducing effect is the concentration of NAA at 0.2～1 mg/L to root,3～5 mg/L to leaf,1～3 mg/L to stem with bud.[Conclusion]All different explants of liquorice can induce adventitious roots in the culture medium with exogenous auxin,however,exogenous cytokinin restraints the inducement of roots.The roots and leaves are ideal explants of liquorice for inducing adventitious roots.

Glycyrrhiza Uralensis Fisch.G.Glabra L.;different explants;exogenous hormones; adventitious root

R285.5

A

1672-1519(2011)01-0075-03

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（09ZCKFSH 01100）。

張 堅(jiān)（1974-），男，博士，副教授，主要從事生藥和組織培養(yǎng)工作。

高文遠(yuǎn)。

2010-09-20）