H1亞型豬流感病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立及其應(yīng)用

高蕾，劉思當(dāng)，肖一紅，劉為民，劉文軍，孫蕾

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018

2 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山 528231

3 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101

豬流感 (Swine influenza，SI) 是由A型流感病毒引起的一種急性、傳染性豬的呼吸道疾病，其特征為突發(fā)、咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱、衰竭，還可導(dǎo)致懷孕母豬繁殖障礙[1-3]。H1與H3亞型豬流感病毒，特別是H1N1、H3N2和H1N2亞型豬流感病毒是引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的重要原因[1]。在我國大陸，郭元吉等于1991年10月至1992年1月間首次在表面健康豬群中分離到了經(jīng)典H1N1亞型SIV[4-5]。2000年之前，未見我國大陸豬群中有經(jīng)典SI流行的報道，而2000年后經(jīng)典SIV的活動顯著提高。2001?2008年，在我國不同地區(qū)和省份的豬場都有分離出H1N1亞型SIV和H3N2亞型的報道[6-9]。研究表明，豬體內(nèi)既含有人流感病毒受體，又含有禽流感病毒受體，因此豬是人流感病毒株與禽流感病毒株的中間宿主和混合器?？赏ㄟ^基因重排產(chǎn)生抗原轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致新流感病毒株的出現(xiàn)，進(jìn)而使病毒可能突破種間障礙，擴(kuò)大感染譜系，危害動物及人類健康[10]。因此，無論是血清學(xué)方面還是病原學(xué)方面，掌握豬群中流感病毒的流行病學(xué)情況，從而預(yù)測人類流感的發(fā)生發(fā)展趨勢，都具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本研究旨在利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá) SIV (H1N1) 流行毒株的HAl重組蛋白，以此為檢測抗原建立檢測SIV (H1N1) 抗體的間接ELISA方法，并用該方法檢測我國H1亞型豬流感病毒的抗體水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α、BL21由本實驗室保存；PMD-18T載體購自TaKaRa公司；pET30a表達(dá)載體購自基因動力公司。

1.1.2 病毒和血清

豬流感病毒H1N1亞型毒株，2008年分離自山東，本實驗室保存；785份豬血清，2008?2009年采集自河北、山東、廣東，本實驗室保存；豬繁殖與呼吸綜合癥病毒 (PRRSV) 陽性血清、豬瘟病毒(CFSV) 陽性血清、豬圓環(huán)病毒二型 (PCV2) 陽性血清、豬流感病毒 H1N1亞型陽性血清和陰性血清和豬流感病毒H3N2亞型 (SIV H3N2) 陽性血清，由本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑

Pfu酶、Taq酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、TMB底物購自北京博邁德公司；Ni-NTA純化柱購自QIAGEN公司；96孔酶標(biāo)板購自Jet公司；豬流感H1N1亞型ELISA抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)并純化H1N1亞型豬流感病毒重組HA1蛋白

原核表達(dá)載體 pET30a-HA1的構(gòu)建：以豬流感病毒H1N1亞型流行株的cDNA為模板，設(shè)計一對引物 (上游引物：5′-CGCGGATCC GCAGACACAC TATG-3′，下劃線所示為BamHⅠ酶切位點；下游引物：5′-CCGCTCGAGTCAAGATTGAATAGAC-3′，下劃線所示為XhoⅠ酶切位點)，擴(kuò)增編碼血凝素蛋白 (HA) 基因精氨酸裂解位點之前的HA1部分 (不含信號肽)，共981 bp。擴(kuò)增出的目的片段連接到T載體上，轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆測序。測序正確的重組質(zhì)粒經(jīng)過BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pET30a (帶有His標(biāo)簽) 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定正確后，送至北京博邁德科技發(fā)展有限公司測序。將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET30a-HA1。

重組蛋白的表達(dá)、純化以及Western blotting檢測：經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，1∶100接種于含有100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min分搖床培養(yǎng)至 OD值為0.6~0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol/L，再培養(yǎng)4 h。SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)后的重組菌4 000 r/min離心20 min收菌，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心20 min分離上清和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)方式。離心后的沉淀用PBST重懸后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，再用1 mmol/L NaCl溶液重懸離心，交替2次洗滌沉淀。沉淀用變性劑 (6 mol/L鹽酸胍，2 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L DTT) 溶解后，采用稀釋復(fù)性法進(jìn)行復(fù)性。復(fù)性后的蛋白利用Ni柱親和層析純化，操作按照步驟。純化后的蛋白使用BCA法檢測蛋白濃度。Western blotting檢測重組HA1蛋白：操作按照步驟[13]：重組蛋白進(jìn)行SDSPAGE后，轉(zhuǎn)膜。一抗 (1∶500) 為豬流感H1N1亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，對照為陰性血清。二抗 (1∶5 000)為HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG。

1.2.2 間接ELISA方法的建立

基本步驟：抗原包被。每孔包被抗原50~200 ng，4 ℃包被過夜或37 ℃包被5 h。用封閉液37 ℃封閉3 h或4 ℃封閉過夜，然后用PBST洗滌3次，每次2 min。將豬血清用稀釋液按一定比例稀釋后，每孔100 μL，37 ℃溫育30 min，用PBST洗滌5次。HRP標(biāo)記二抗用稀釋液按一定比例稀釋后，每孔100 μL，37 ℃溫育30 min，用PBST洗滌5次。每孔加入TMB顯色液100 μL，37 ℃溫育10 min后加入終止液，每孔100 μL。最后酶標(biāo)儀測定A450。

反應(yīng)條件的優(yōu)化：采用棋盤法[8]。重組蛋白用包被液分別稀釋至0.125、0.25、0.5、1、2 μg/mL，包被到 96孔板上。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400梯度稀釋。棋盤法確定最佳反應(yīng)條件。酶標(biāo)二抗按照 1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000梯度稀釋，確定最佳反應(yīng)條件。標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD450值在1.0左右，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清 OD450值較低，二者之比最大時的反應(yīng)條件為最佳。

特異性試驗：分別將常見豬病病毒陽性血清作最佳稀釋，進(jìn)行ELISA檢測，同時設(shè)立豬流感病毒H1N1亞型陽性血清和陰性血清作對照。

重復(fù)性試驗：批內(nèi)重復(fù)性：將同一批次包被有重組抗原的ELISA檢測板分別檢測10份血清，每份重復(fù) 3次，計算其變異系數(shù)。批間重復(fù)性：將不同批次的包被有重組抗原的ELISA檢測板分別檢測10份血清，每份重復(fù)3次，計算其變異系數(shù)。

臨界值的確定：結(jié)果計算：S/P值=(待測樣本OD450?陰性對照 OD450)/(陽性對照 OD450?陰性對照OD450)，以豬流感H1N1亞型ELISA抗體檢測試劑盒 (IDEXX) 作為參照，將試劑盒檢出的 100份陽性血清和 100份陰性血清用本方法進(jìn)行檢測。二者的結(jié)果輸入統(tǒng)計軟件SPSS (14.0) 進(jìn)行ROC分析確定臨界值。

1.2.3 臨床樣本的檢測及與試劑盒檢測結(jié)果的比較

檢測2008?2009年采集自河北省、山東省、廣東省的豬血清785份，并與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果比較，使用統(tǒng)計軟件SPSS (14.0) 進(jìn)行ROC分析，計算其診斷特異性 (Diagnostic specificity，DSP) 和敏感性 (Diagnostic sensitivity，DSN)。DSN=真陽性樣本數(shù)/(真陽性樣本數(shù)+假陰性樣本數(shù))，DSP=真陰性樣本數(shù)/(真陰性樣本數(shù)+假陽性樣本數(shù))。

2 結(jié)果

2.1 H1N1亞型豬流感病毒重組HA1蛋白的原核表達(dá)及純化

2.1.1 原核表達(dá)載體pET30a-HA1的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物及重組載體pET30a-HA1雙酶切后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約1 000 bp處有特異性條帶(圖1)。測序結(jié)果表明，目的基因序列未發(fā)生突變堿基，且閱讀框正確，表明成功構(gòu)建含有HA1基因的重組表達(dá)載體pET30a-HA1。

2.1.2 重組蛋白的表達(dá)、復(fù)性和純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在37 ℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1 mmol/L，培養(yǎng)4 h，蛋白得到高效表達(dá)。蛋白表達(dá)情況經(jīng) SDS-PAGE和 Western blotting檢測 (圖2)，目的蛋白大小約為50 kDa，可以與豬流感病毒 H1N1亞型陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。純化后的蛋白濃度為0.410 mg/mL。

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

圖1 PCR及重組載體雙酶切鑒定結(jié)果Fig. 1 Results of PCR and recombinant plasmid digested by restriction endonucleases. (A) PCR products of HA1 gene. M: DNA marker; 1: negative control; 2,3: PCR products. (B) Identification of recombinant plasmid digested by restriction endonucleases. M: DNA marker; 1: negative control; 2: digestion products.

棋盤法結(jié)果表明：抗原最佳包被量、血清最佳稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)二抗最佳稀釋倍數(shù)分別為：0.5 μg/mL，1∶100和1∶10 000 (圖3A)。

2.2.2 特異性試驗和重復(fù)性試驗

特異性試驗：包被抗原與其他常見豬病病毒陽性血清沒有交叉反應(yīng) (圖 3B)，其中豬流感病毒H3N2亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的檢測值 (0.20) 與陰性血清的檢測值 (0.18) 沒有顯著性差異 (P＜0.05)，說明該H1亞型豬流感病毒包被抗原與H3亞型豬流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清沒有交叉反應(yīng)。

重復(fù)性試驗：批內(nèi)重復(fù)性，變異系數(shù)為0.56%~ 8.21%，低于10%；批間重復(fù)性，變異系數(shù)為4.15%~ 14.5%，低于15%，說明該體系較穩(wěn)定。

圖2 表達(dá)蛋白的SDS-PAGE (A) 和Western blotting (B) 結(jié)果Fig. 2 SDS-PAGE analysis (A) and Western blotting analysis (B) of the recombinant protein. (A) SDS-PAGE analysis. M: protein marker; 1: bacteria lysate before inducing; 2: bacteria lysate after inducing; 3: supernatant; 4: sediment; 5: the purified protein. (B) Western blotting analysis of the purified recombinant HA1-protein. 1: treating with negative serum; 2: treating with anti-SIV H1N1 serum; M: protein marker.

圖3 反應(yīng)條件的優(yōu)化和特異性實驗Fig. 3 Optimization of ELISA working conditions and specificity of ELISA. optimization of antigen concentration (A), serum sample dilution (B), conjugate dilution (C) and specificity of ELISA (D).

2.2.3 臨界值的確定

通過ROC分析，臨界值為S/P=0.26，檢測結(jié)果高于0.26，判定為陽性；低于0.26，判定為陰性。

2.3 臨床樣本的檢測及與試劑盒檢測結(jié)果的比較

2.3.1 臨床樣本的檢測

共檢測2008?2009年采集自河北省、山東省、廣東省的豬血清785份。其中陽性122份，陰性663份，陽性率為15.54%，各省的陽性率分別為河北省8.15% (30/368)；山東省 9.78% (27/276)；廣東省46.10% (65/141)。

2.3.2 與IDEXX試劑盒檢測結(jié)果的比較

使用豬流感 H1亞型 ELISA抗體檢測試劑盒(IDEXX)對785份血清進(jìn)行檢測，將SIV(H1)ELISA檢測結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比較 (表 1)：以IDEXX試劑盒檢測結(jié)果作為參照，SIV(H1)ELISA檢測的診斷特異性 (DSP) 達(dá)到95% (87/96)，診斷敏感性 (DSN) 達(dá)到91% (654/689)。

表1 H1N1亞型豬流感ELISA檢測與IDEXX試劑盒檢測785份豬血清的結(jié)果比較Table 1 Comparison of the SIV (H1N1) ELISA and the IDEXX ELISA for 785 field sera

3 討論

血凝素 (HA) 是SIV變異、病毒毒力和宿主特異性的主要決定因素，是病毒的表面抗原[9-10]，具有免疫原性，也是誘導(dǎo)體液免疫最主要的保護(hù)性抗原[17-18]。HA分為重鏈HAl和輕鏈HA2，兩者之間以一個精氨酸相連。HA的大部分抗原決定簇集中在HAl上，因此，HAl具有HA的主要抗原表位[19-20]。本實驗利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了 2008年分離到的SIV (H1N1) 毒株的HA1區(qū)域，重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，并對其進(jìn)行了變性、復(fù)性，使其蛋白構(gòu)象更接近于其天然構(gòu)象，從而保證其抗原表位的準(zhǔn)確性。Western blotting檢測結(jié)果表明，HA1蛋白能夠被H1N1亞型SIV抗血清所特異性識別，證明所表達(dá)的重組蛋白具有很好的免疫學(xué)活性。

H1與H3亞型豬流感病毒，特別是H1N1、H3N2和 H1N2亞型豬流感病毒是引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的重要原因，在世界范圍內(nèi)顯地方流行性[1]。經(jīng)過長期的進(jìn)化，這 3種亞型的病毒已成為豬體內(nèi)的適應(yīng)毒株，長期穩(wěn)定存在于豬群中，嚴(yán)重危害著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感，其病原甲型 H1N1流感病毒的所有基因片段來源于目前流行的SIV[3-10]，而且近年來國內(nèi)外不斷有分離到基因重排H1亞型豬流感病毒的報道[21-23]。了解豬流感的感染情況，不僅可為促進(jìn)養(yǎng)豬的健康發(fā)展提供制定防控計劃的科學(xué)依據(jù)，也是防控人流感的重要環(huán)節(jié)。血清學(xué)調(diào)查是防控豬流感的必要手段，而建立行之有效的檢測方法就成了當(dāng)務(wù)之急。本研究利用建立的ELISA方法檢測了2008?2009年自河北、山東、廣東省所采集的豬血清共785份，發(fā)現(xiàn)其陽性率為 15.54% (122/785)，不同省份的陽性率也存在差異 (8%~47%)。其中河北省與廣東省檢測陽性率差異較大 (分別為8.15%和46.1%)，分析其原因比較復(fù)雜，一方面可能是由于地理位置相隔較遠(yuǎn)，氣候和環(huán)境的不同導(dǎo)致 H1亞型豬流感的感染和流行情況有差異；另一方面，采樣時機(jī)和采樣豬場也對檢測結(jié)果有較大的影響；而且每個省我們只檢測了數(shù)百份樣品，可能未能充分地反映當(dāng)?shù)刎i群的抗體水平。其他文獻(xiàn)報道[24-25]，2004?2007年采集自福建省的豬血清，H1亞型豬流感抗體陽性率為45.5% (413/908)；1999?2009年全國范圍內(nèi)采集的豬血清，H1亞型豬流感抗體陽性率為31.1% (3478/11168)，不同地區(qū)存在差異 (2.4%~38.0%)，說明豬場存在較普遍的H1亞型豬流感的感染。

我們將臨界值定為0.26 (S/P)，本方法的檢測結(jié)果與常用的IDEXX試劑盒檢測結(jié)果相比，診斷敏感性達(dá)到91%，診斷特異性達(dá)到95%，說明兩種方法的符合率很高。而對于大規(guī)模的血清學(xué)檢測來說，在保證檢測準(zhǔn)確性的前提下，檢測成本以及安全性也是重要的因素。本研究建立的 SIV(H1N1)ELISA利用原核表達(dá)獲得重組蛋白，容易獲得純化的蛋白，保證檢測的特異性，與全病毒包被抗原相比，杜絕了安全隱患，大大降低了生產(chǎn)成本，具有較好的應(yīng)用前景。

[1] Brown IH. The epidemiology and evolution of inflsuenza viruses in pigs. Vet Microbiol, 2000, 74(1/2): 29?46.

[2] Heinen PP, De Boer-Luijtze EA, Bianchi ATJ. Respiratory and systemic humoral and cellular immune responses of pigs to a heterosubtypic influenza A virus infection. J Gen Virol, 2001, 82(11): 2697?2707.

[3] Choi YK, Goyal SW, Joo HS. Prevalence of swine influenza virus subtypes on swine farms in the unitedstates. Arch Virol, 2002, 147(6): 1209?1220.

[4] Guo YJ, Webster RG, Zhuge YH, et al. The discovery and source-investigation of swine influenza virus (H1N1) in Chinese pig population. Chin J Exp Clin Virol, 1992, 6(4): 347?351.郭元吉, Webster RG, 諸葛亞輝, 等. 我國豬群中豬型(H1N1) 流感病毒的發(fā)現(xiàn)及其來源的調(diào)查. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 1992, 6(4): 347?351.

[5] Guo YJ, Webster RG, Wang M. Analysis of nucleotide sequence of Haemagglutinin gene of swine Influenza A virus. Chin J Exp Clin Virol, 1995, 9(1): 11?14.郭元吉, Webster RG, 王敏. 豬型流感病毒血凝素基因的核苷酸全序列分析. 中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志, 1995, 9(1): 11?14.

[6] Wang LX, Bi YZ, Cao YC. Cloning and sequence analysis of the HA partial gene of six strains of swine influenza virus. Chin J Vet Sci, 2003, 23(5): 438?441.王連想, 畢英佐, 曹永長. 6株豬流感病毒分離株HA部分基因的克隆和序列分析. 中國獸醫(yī)學(xué)報, 2003, 23(5): 438?441.

[7] Chen JY, Li HY, Shen ZY, et al. Molecular evolution of hemagglutinin gene of H1N1 subtype swine influenza viruses isolated from the mainland of China. Chin J Pre Vet Med, 2005, 27(1): 13?17.陳君彥, 李海燕, 申之義, 等. H1N1亞型豬流感病毒中國分離株血凝素基因分子演化的研究. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報, 2005, 27(1): 13?17.

[8] Wei H, Zhang DM, Zhuang XS, et al. Isolation and identification of a prevalent swine influenza virus strain from Fujian. J South China Agri Univ, 2007, 28(2): 119?121.魏宏, 張德明, 莊向生, 等. 豬流感福建流行毒株的分離、鑒定. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 28(2): 119?121.

[9] Wen NH, Wu DM, Song YH, et al. Isolation and identification of type A swine influenza virus. Protein Vet Med, 2008, 29(4): 53?55.溫納華, 吳德銘, 宋延華, 等. 豬流感病毒的分離與鑒定. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 29(4): 53?55.

[10] Ito T, Couceiro JN, Kelm S, et al. Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential. J Virol, 1998, 72(9): 7367?7373.

[11] Smith GJ, Vijaykrishna D, Bahl J, et al. Origins and evolutionary genomics of the 2009 swine-origin H1N1 influenza A epidemic. Nature, 2009, 459(7250): 1122?1125. [12] Garten RJ, Davis CT, Russell CA, et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science, 2009, 325(5937): 197?201.

[13] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: A840?A4854.

[14] Crowther JR. The ELISA Guidebook//Methods in Molecular Biology. Totowa: Humana Press, 2000: 1?413.

[15] Zhou NN, Senne DA, Landgraf JS, et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs. J Virol, 1999, 73(10): 8851?8856.

[16] Steinhauer DA. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogencity of influenza virus. Virology, 1999, 258(1): 1?20.

[17] Skehei JJ, Wiley DC. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem, 2000, 69(7): 531?569.

[18] Raymond FL, Caton AJ, Cox NJ, et al. The antigenicity and evolution of influenza H1 haemagglutinin, from 1950-1957 and 1977-1983: two pathways from one gene. Virology, 1986, 148(2): 275?287.

[19] Bush RM, Fitch WM, Bender CA, et al. Positive selection on the H3 hemagglutinin gene of human influenza virus A. Mol Biol Evol, 1999, 16(11): 1457?1465.

[20] Caton AJ, Brownlee GG, Yewdell JW, et al. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (H1 subtype). Cell, 1982, 31(2 Pt 1): 417?427.

[21] Choi YK, Goyal SM, Farnham MW, et al. Phylogenetic analysis of H1N2 isolates of influenza A virus from pigs in the United States. Virus Res, 2002, 87(2): 173?179.

[22] Jung K, Chae C. Phylogenetic analysis of an H1N2 influenza a virus isolated from a pig in Korea. Arch Virol, 2004, 149(7): 1415?1422.

[23] Qi X, Lu CP. Genetic characterization of novel reassortant H1N2 influenza A viruses isolated from pigs in southeastern China. Arch Virol, 2006, 151(11): 2289?2299.

[24] Song XH, Xiao H, Huang Y, et al. Serological surveillance of influenza a virus infection in swine populations in fujian province, China: no evidence of naturally occurring H5N1 infection in pigs. Zoonoses Public Health, 2010, 57(4): 291?298.

[25] Liu W, Wei MT, Tong Y, et al. Seroprevalence and genetic characteristics of five subtypes of influenza a viruses in the Chinese pig population: a pooled data analysis. Vet J, 2011, 187(2): 200?206.