異煙肼在家兔體內(nèi)的死后分布研究1）

常明亮，任 飛，贠克明，賈美娟

異煙肼（INH），又名雷米封（Rimifen），為臨床抗結(jié)核藥，毒性較大，不良反應(yīng)嚴(yán)重、多樣，主要中毒癥狀有：步態(tài)不穩(wěn)或麻木針刺感、燒灼感或手腳疼痛；深色尿、眼或皮膚黃染；異常乏力或軟弱、惡心或嘔吐；偶有視力模糊或視力減退、發(fā)熱、皮疹等。雖然毒性較強(qiáng)，但因尚無可取代的藥物，目前仍為臨床一線抗結(jié)核藥［1，2］，服藥過量或 自 殺 中 毒 死 亡 事 件 時(shí) 有 發(fā) 生［3－7］，需 進(jìn) 行 法醫(yī)學(xué)鑒定。

有關(guān)異煙肼法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道較少，僅見生物檢材內(nèi)異煙肼的檢測方法、個(gè)別中毒（死）案件的檢驗(yàn)報(bào)道［9－15］，但對(duì)中毒死亡者體內(nèi)的分布情況報(bào)道甚少，所以需進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)

的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究。本研究建立異煙肼口服中毒致死大鼠的動(dòng)物模型，研究異煙肼在中毒致死家兔的體內(nèi)分布，為異煙肼中毒（死）案件的法醫(yī)學(xué)鑒定提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品 異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品（公安部二所提供），SDE（水楊醛）；異煙肼標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 mg/m L水溶液；SDE標(biāo)準(zhǔn)溶液：250 mL水中加入2.5 m L SDE，振搖，靜置，4℃冰箱保存待用；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。異煙肼片劑：每片100 mg，天生制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：0801002。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性家兔，體重（2.0±0.7）kg，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 儀器與分析條件

1.3.1 儀器 CS－930薄層色譜掃描儀（日本島津）；日本島津高效液相色譜儀，WDL－95色譜工作站。

1.3.2 分析條件 薄層色譜法條件，薄層板∶HSGF25410 cm×10 cm×0.25 mm；展開劑：三氯甲烷：甲醇（9∶1），上行展開5 cm～7 cm。光譜掃描：200 nm～370 nm，Difference掃描方式，記錄吸光度，進(jìn)行定性分析。液相色譜條件，色譜分離柱：YWG－C18柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；預(yù)柱：YWG－C18柱（6 mm×25 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.02 mol/L磷酸二氫鉀－甲醇（65∶35）；檢測波長295 nm；流速：1 m L/min；進(jìn)樣量20μL。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 健康家兔6只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（4只）和對(duì)照組（2只），隔夜禁食，實(shí)驗(yàn)期間補(bǔ)充生理鹽水。家兔仰臥位固定于兔臺(tái)，開口器將口打開并固定，經(jīng)開口器中孔，沿咽后壁正中線向下插入導(dǎo)尿管（25 cm～28 cm），用注射器推入2 mL～3 m L空氣，確證導(dǎo)尿管入胃后，經(jīng)導(dǎo)尿管注入異煙肼0.56 mg/kg（2倍LD50），再注入水5 m L～10 m L，夾閉導(dǎo)尿管末端，緩緩拔出導(dǎo)尿管。家兔死亡后，迅速解剖動(dòng)物，取心血和玻璃體液各2 m L，在血液中分別加入肝素鈉溶液0.5 m L，依次取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、腦、胃壁臟器部分組織，放置于－20℃冰箱內(nèi)保存待檢。

1.4.2 組織臟器、體液中異煙肼的檢測

1.4.2.1 異煙肼的定性檢測 固性組織檢材取2 g，加水3 m L勻漿，加飽和硫酸銨溶4 m L，80℃～90℃水浴15 min，冷卻至室溫，1800 r/min離心20 min，取上清液2.5 m L加等量SDE飽和水溶液，40℃水浴20 min～30 min，冷卻至室溫，加乙酸乙酯8 mL，振蕩15 min，1800 r/min，離心10 min，分取有機(jī)層，80℃或40℃水浴，揮干。乙酸乙酯100μL定容，5μL點(diǎn)樣，于展開劑（三氯甲烷∶甲醇為9∶1）中展開，Rf值結(jié)合光譜掃描定性。血或玻璃體液2.5 m L直接加SDE飽和水溶液2.5 m L，余同固性檢材。

1.4.2.2 異煙肼的定量檢測 別取血或玻璃體液樣品各0.25 m L于1 m L離心試管中，加入10%三氯醋酸50μL，1.6%水楊醛溶液40μL，加甲醇至0.5 m L后于40℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，高速離心（10000 r/min）5 min。吸取全部上清液，稀釋10倍后，取稀釋液20μL進(jìn)樣，HPLC檢測。外標(biāo)法定量。取勻漿后的各臟器樣品0.5 g于1 m L離心試管中，加入10%三氯醋酸50μL，1.6%水楊醛溶液40μL，甲醇0.5 m L，經(jīng)混旋后于50℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，余同體液樣品。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

《新三字經(jīng)》里說：“人之初，如玉璞?！比说南忍觳o好壞之分、善惡之別，只因受家庭、學(xué)校教育和社會(huì)的影響，才有所謂好學(xué)生與落后學(xué)生，好人與壞人之分。一個(gè)班級(jí)、一個(gè)學(xué)校總在不同程度上有后進(jìn)生的存在。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物表現(xiàn) 家兔在INH灌胃后30 min左右便開始出現(xiàn)呼吸抑制、昏迷、全身陣發(fā)性強(qiáng)直性痙攣，呈癲癇大發(fā)作樣抽搐，有不同程度的共濟(jì)失調(diào)，于2 h±30 min死亡。

2.2 異煙肼的檢測

2.2.1 異煙肼衍生化薄層色譜掃描檢測 異煙肼、水楊醛、異煙肼－水楊醛腙薄層分析Rf值分別為：INH（Rf＝0.39），INH 之SDE衍生物（Rf＝0.56），SDE（Rf＝0.93）。

2.2.2 異煙肼衍生化后高效液相色譜圖（見圖1～圖3）

2.2.3 工作曲線（見表1） 取空白血液樣品各7份（每份0.25 m L）于離心試管中，分別加入濃度為0.5 mg/L的INH標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2μL、0.8μL、2.0μL、4.0μL、8.0μL、12.0μL、15.0μL；再加入10%三氯醋酸50μL和1.6%水楊醛溶液40μL，加甲醇至0.5 mL，配制成濃度為0.2 mg/L、0.8 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、8.0 mg/L、12.0 mg/L、15.0 mg/L標(biāo)準(zhǔn)異煙肼體液樣品，于40℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻，高速離心（10000 r/min）5 min。取上清液20μL進(jìn)樣。

表1 異煙肼工作曲線

2.2.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 分別取15份空白血液各1 m L，15份空白肝臟各1 g，均分為3組。每組分別加入異煙肼0.4 μg/m L、4μg/m L、8μg/m L，提取檢測。同時(shí)取1 d內(nèi)5次測定結(jié)果計(jì)算日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，以3 d內(nèi)5次測定結(jié)果計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，詳見表2。

表2 異煙肼回收率及精密度

2.3 染毒家兔實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表3） 胃＞腎＞血＞玻璃體液＞心＞腦＞脾＞肺＞?。靖?，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 2倍LD50劑量染毒致死家兔體內(nèi)異煙肼含量 μg/g

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，在給藥異煙肼2倍LD50劑量（560 mg/kg）150 min內(nèi)6只家兔死亡，異煙肼2倍LD50劑量中毒致死家兔心、肝、脾、肺、腎、胃、腦、肌肉、血、玻璃體液內(nèi)的異煙肼的含量分別為（31.22±16.15）μg/g（μg/mL）、（18.50±12.61）μg/g、（25.62 ±1.37）μg/g、（20.89±5.18）μg/g、（52.98±8.60）μg/g、（131.59±15.30）μg/g、（28.20±8.50）μg/g、（20.30±7.50）μg/g、（45.4±12.2）μg/g、（40.8±16.3）μg/g，其異煙肼含量排列順序?yàn)椋何福灸I＞血＞玻璃體液＞心＞腦＞脾＞肺＞肌肉＞肝，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。異煙肼由它的中毒原因決定了胃中含量較高，腎的含量較高可能是與異煙肼為水溶性藥物而且該臟器為異煙肼的主要排泄解毒器官有關(guān)，肝中含量較低可能是由大劑量藥物促使家兔急死，血液中藥物未完全分布到肝臟。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與金鳴等［16，17］報(bào)道的200 mg/kg灌胃家兔體內(nèi)INH的死后分布趨勢（胃＞腎＞玻璃體液＞肺＞腦＞血＞心＞肝）不同。低劑量（200 mg/kg）組較其高劑量（560 mg/kg）組心、血、濃度較低，肺濃度較高。這可能是由于高劑量組家兔死亡快，血液中藥物未完全分布組織臟器中，導(dǎo)致血中濃度高。兩組數(shù)據(jù)中一致顯示腎的濃度都相對(duì)較高。考慮高低劑量兩組腎均系家兔主要解毒器官。因此，INH不同劑量組在家兔體內(nèi)分布趨勢不完全相同。提示INH中毒（死）案件法醫(yī)學(xué)鑒定時(shí)，宜采取腎、玻璃體液、腦等受劑量影響小的臟器，并應(yīng)考慮中毒量及中毒死亡時(shí)間，進(jìn)行全面定性和定量分析。

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