新疆石榴皮多酚對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的藥效學(xué)研究

張 燕 張 紅 迪麗胡瑪爾 張?之*

1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000;2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000; 3.新疆醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，新疆烏魯木齊830011

石榴 (Punica granatum L.)，維吾爾語稱“阿娜爾”，是新疆和田、喀什等地特色果品，《本草綱目》記載具有止血解毒功效［1］。近年來因其抗氧化、抗菌抗炎、抗腫瘤、抗粘膜損傷、降糖降脂［2－5］等多種藥理學(xué)活性成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)。潰瘍性結(jié)腸炎 (UC)在我國呈逐年上升趨勢，是結(jié)腸癌的高危因素，被WHO列為現(xiàn)代疑難病之一［6］。本實(shí)驗(yàn)觀察了PPPE對UC小鼠的抗炎作用并探討其免疫相關(guān)機(jī)制，為石榴皮的深入開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 TNBS，50g·L－1，美國Sigma;柳氮磺胺吡啶，上海三維制藥;IL－17、IL－4試劑盒，北京福瑞生物公司;豚鼠血清，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器 賽多利斯電子分析天平、Hair超低溫冰箱、山東新華組織勻漿機(jī)、UV－2000分光光度計(jì)、BIO－RAD酶標(biāo)儀等。

1.3 動(dòng)物 健康昆明種 (KM)小鼠，雌雄各半，體重18～22g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PPPE提取及總多酚含量測定 將新疆葉城縣石榴剝皮曬干粉碎、過20目篩，粗粉按料液比1∶20(g∶mL)用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇提取，濾液50℃真空濃縮冷凍干燥，得石榴皮多酚黃色粉末。Folin－Ciocalteu法測定，以沒食子酸表示的總多酚含量為32.7%。

2.2 動(dòng)物分組給藥 KM小鼠隨機(jī)分4組，禁食12 h，分別i.g PPPE(500 mg·kg－1·d－1)、陽性對照柳氮磺胺吡啶 (SASP，0.5 g·kg－1·d－1)或等體積去離子水 (空白對照組和TNBS模型組)15 d.在連續(xù)給藥的第10 d，除空白對照其余各組小鼠乙醚輕度麻醉，用直徑2 mm的灌腸器從肛門處插入結(jié)腸約4 cm處，注入25 g·L－1TNBS50%乙醇溶液 0.1 m L·10 g－1(分兩次間隔12 h)，造成結(jié)腸炎模型［7］。在連續(xù)給藥的第11 d，除空白對照組外，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2 m L進(jìn)行免疫，各組小鼠在末次給藥24 h后取血處死。

2.3 一般情況觀察 每隔三日測大鼠體質(zhì)量、觀察糞便性狀和隱血情況，參照文獻(xiàn)［8］行疾病活動(dòng)指數(shù)評分。

2.4 結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)評分 截取肛門至盲端腸段，沿腸系膜縱行剖開，用預(yù)冷的生理鹽水迅速?zèng)_凈，參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行改進(jìn)見下表，按該表計(jì)評各組總分值。

結(jié)腸粘膜狀況 分值腹腔粘連:無、輕度、中度、重度 分別記0、1、2、3分充血:無、輕度、中度、高度 同上水腫:無、輕度、中度或粘膜粗糙呈顆粒感、高度同上潰瘍糜爛:無、輕度、中度、嚴(yán)重糜爛、壞死及潰瘍1處最大縱徑﹤1cm 分別記0、1、2、3、4分潰瘍＞1處、潰瘍最大縱徑每超過1cm、腸壁增厚、穿孔，全段腸壁壞死、中毒性巨結(jié)腸、死亡加1分粘連+充血+水腫+潰瘍+加分項(xiàng)分值=總分值

2.5 血清溶血素 (SH)測定 取血，1500 r·min－1離心10 min得血清，用生理鹽水按1∶100稀釋，取稀釋血清1 m L，分別加入體積分?jǐn)?shù)5%的雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL，體積分?jǐn)?shù)10%的豚鼠血清0.5 mL混勻，37℃溫育30 min后，0℃冰水中終止反應(yīng)，1 500 r·min－1離心10min，取上清液于540nm測吸光度值。

2.6 取脾臟、胸腺、結(jié)腸稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。取部分結(jié)腸、脾臟組織10%甲醛固定，石蠟包埋切片HE染色觀察組織病理學(xué)變化，剩余部分－80℃冷凍備用。

2.7 制備10%結(jié)腸組織勻漿，按試劑盒說明書酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細(xì)胞因子IL－4，IL－17水平。

3 結(jié)果

3.1 PPPE對疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)的影響

模型組小鼠體重下降，大便稀且有粘液便、血便，結(jié)腸黏膜出現(xiàn)不同程度的充血、水腫、增厚、糜爛潰瘍等，DAI值及CMDI評分顯著高于正常組，經(jīng)PPPE干預(yù)后DAI及CMDI明顯改善，部分小鼠腸道可見潰瘍愈合疤點(diǎn)。結(jié)果見表1。

表1 各組DAI及CMDI比較±s，n=8)

表1 各組DAI及CMDI比較±s，n=8)

與正常對照組比:#;與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01 (下同)

GROUP DAI CMDI＊＊Normal 0.05±0.01 0.00±0.00 TNBS 7.63±1.59## 9.83±1.64## SASP 4.50±1.19＊＊ 4.20±1.39＊＊PPPE 3.50±1.93＊＊ 4.38±1.42

3.2 PPPE對臟器指數(shù)的影響

模型組腸重指數(shù)提高、胸腺指數(shù)降低，這與肉眼觀察到的模型組有結(jié)腸腫大增厚及胸腺明顯萎縮相一致。PPPE能降低腸重指數(shù) (P﹤0.05)，顯著提高脾臟指數(shù)但與模型組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與取樣時(shí)間有關(guān)，該時(shí)模型組脾臟可能也有代償性增生。結(jié)果見表2。

表2 各組IWI、SI、THI比較±s，n=8)

表2 各組IWI、SI、THI比較±s，n=8)

GROUP IWI(g·g－1) SI(mg·g－1) THI(mg·g－1) Normal 0.015±0.003 2.91±0.70 2.43±0.60 TNBS 0.024±0.010# 3.52±0.18 1.02±0.21# SASP 0.021±0.005 3.13±0.51 2.33±0.41* PPPE 0.016±0.002*4.19±0.09# 1.35±0.13

3.3 PPPE對血清溶血素及結(jié)腸組織細(xì)胞因子的影響

脾細(xì)胞生成的抗體在補(bǔ)體存在條件下與抗原結(jié)合發(fā)生溶血反應(yīng)，模型組血清溶血素明顯降低，IL－17水平增高，SASP組、PPPE組顯著升高血清溶血素水平，降低IL－17水平，說明PPPE能提高小鼠體液免疫功能，降低炎性細(xì)胞因子水平，結(jié)果見表3。

表3 各組血清溶血素及結(jié)腸組織細(xì)胞IL－17 IL－4含量比較 ±，n=8)

表3 各組血清溶血素及結(jié)腸組織細(xì)胞IL－17 IL－4含量比較 ±，n=8)

GROUP SH IL－17/pg·ml－1 IL－4/pg·ml －1 Normal 0.976+0.015 219.02±83.21 197.61±21.62 TNBS 0.180+0.053# 675.26±238.75# 126.25±51.41# SASP 0.570+0.201* 301.18±75.22* 139.64±69.78 PPPE 0.683+0.140* 298.47±114.16*141.91±77.31

3.4 結(jié)腸粘膜組織病理學(xué)變化 光學(xué)顯微鏡下可見正常組結(jié)腸結(jié)構(gòu)清晰，上皮完整，粘膜層連續(xù)、層次明顯，杯狀細(xì)胞豐富，各細(xì)胞排列的緊密，腺管結(jié)構(gòu)正常，無炎細(xì)胞浸潤;模型組上皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p壞，黏膜脫落或壞死，黏膜和黏膜下層大量炎癥細(xì)胞浸潤，粘膜下水腫，潰瘍形成，腺體壞死;SASP組粘膜連續(xù)，粘膜下層少量炎癥細(xì)胞浸潤;PPP組粘膜完整，有水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)腸病理狀態(tài)明顯改善。見圖1。

3.5 脾臟組織病理學(xué)變化 正常對照組結(jié)構(gòu)清楚，白髓中淋巴細(xì)胞密集;模型組白髓明顯減少，淋巴細(xì)胞密集度明顯下降;SASP陽性對照組有些區(qū)域白髓萎縮，淋巴細(xì)胞有減少;PPPE治療組接近正常。見圖2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對結(jié)腸粘膜損傷指數(shù)評分方法進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，使各項(xiàng)指標(biāo)清晰明確，每項(xiàng)指標(biāo)又按程度給予不同層次評分，可操作性增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)石榴皮多酚對結(jié)腸炎癥損傷有明顯改善作用，其藥效可能與下調(diào)炎性細(xì)胞因子IL－17水平、提高脾臟抗體生成能力有一定關(guān)系。陽性對照柳氮磺胺吡啶組一只小鼠出現(xiàn)結(jié)腸膨大腫粗現(xiàn)象，有待研究。

目前結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但大量研究表明免疫系統(tǒng)異常起著至關(guān)重要的作用［10］。近年研究發(fā)現(xiàn)輔助型Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL－17，很可能在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病中發(fā)揮關(guān)鍵性免疫調(diào)節(jié)作用［11－12］，細(xì)胞因子IL－17與受體結(jié)合后，可通過活化MAP激酶和激活轉(zhuǎn)錄因子NF－κB，強(qiáng)大地募集和激活嗜中性粒細(xì)胞，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì):IL－1、6、8，TNF－α，NOS－2，單核細(xì)胞趨化蛋白－1 (MCP－1)、CAM－1、金屬蛋白酶和化學(xué)增活素而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)局部化和擴(kuò)大化，導(dǎo)致自身免疫性損傷甚至促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展［13］。學(xué)者推測對抗IL－17可能成為治療UC的一個(gè)新手段，因此按現(xiàn)代作用靶點(diǎn)思路從傳統(tǒng)中藥中進(jìn)一步尋找其有效成分對中藥現(xiàn)代化開發(fā)有重大前景。

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