實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)的改變及bFGF表達(dá)的改變

高 尚,丁麗宏,汪劍威,圖門烏力吉*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

糖尿病神經(jīng)病變（DNP）是糖尿病最常見的并發(fā)癥以及是病人致殘的主要原因之一,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命健康[1]。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）,能促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠海馬、皮層隔、丘腦神經(jīng)元的存活和突起的生長,以及脊髓神經(jīng)元（雞胚）的存活[2,3]。在病理情況下細(xì)胞因子的異常表達(dá)多與系統(tǒng)或器官疾病的產(chǎn)生、發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對糖尿病大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察,檢測結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中bFGF的表達(dá),探討細(xì)胞因子bFGF對糖尿病周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)生、發(fā)展的影響,為糖尿病周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的發(fā)病機(jī)制和治療提供一定的形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組

選用雄性健康SD大鼠25只,體重160 g-180 g,隨機(jī)分為2組,對照組10只,模型組15只。用0.1M pH=6.0枸櫞酸鹽緩沖液,將脲佐菌素配成2%新鮮脲佐菌素（STZ）溶液,濾菌器除菌,以60mg/kg劑量一次性腹腔注射。正常對照組用等量生理鹽水腹腔注射。選擇注射STZ后72 h尾靜脈取血測血糖,血糖≥16.7mmol/l,尿量以及飲水量明顯增多者列入糖尿病實(shí)驗(yàn)大鼠模型,本組有13只造模成功。期間動(dòng)物統(tǒng)一籠養(yǎng),喂以基礎(chǔ)飼料,自由進(jìn)水,不進(jìn)行胰島素注射治療,每兩周測體重和血糖。

1.2 標(biāo)本收集及檢測方法

飼養(yǎng)8周后所有的大鼠稱取體重,均禁食水10小時(shí),尾靜脈取血測血糖。動(dòng)物處死前5%烏拉坦腹腔注射麻醉（1.0ml/100 g體重）。在頸部正中線處,作4 cm切口,借助手術(shù)顯微鏡,找出左右側(cè)頸動(dòng)脈鞘,并仔細(xì)分離出迷走神經(jīng),至顱底頸靜脈孔即迷走神經(jīng)離開顱腔處,立即取左側(cè)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)制備電鏡標(biāo)本,右側(cè)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)固定于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片,采用免疫組化染色,觀察結(jié)狀神經(jīng)節(jié)bFGF表達(dá)（bFGF試劑盒購于Sigma公司）。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見染成棕黃色顆粒的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,認(rèn)定為表達(dá)陽性細(xì)胞。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng),在400倍視野下每張切片取5個(gè)視野,測定平均灰度值作半定量分析,用以反映其蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組大鼠注射藥物后,整體狀態(tài)差糖尿病大鼠組較正常對照組明顯開始消瘦,大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食癥狀,行動(dòng)遲緩,精神萎靡不振、體毛發(fā)黃、稀疏、掉毛,反應(yīng)遲緩等癥狀,血糖值與正常對照組比較維持在（＞16.7 mmol/l）水平（體重及血糖見表1和表2）。

表1 對照組與糖尿病組體重（克）值比較

表2 對照組與糖尿病組血糖值（mmol/L）比較

2.2 結(jié)狀神經(jīng)節(jié)電鏡結(jié)果

電子顯微鏡下正常對照組大鼠的細(xì)胞核,呈規(guī)則的圓形或橢圓形,核內(nèi)顆粒均勻一致,核仁清晰可見,著色深。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的細(xì)胞器:大量的尼氏體（合成蛋白質(zhì)的場所）;線粒體數(shù)量較多,呈圓形或橢圓形,嵴呈板狀或管狀,基質(zhì)內(nèi)顆粒較少;高爾基復(fù)合體比較發(fā)達(dá),常由扁平囊、光滑小泡、有衣小泡和大泡組成;高爾基復(fù)合體附近有很多的溶酶體;可見有大小不等的,形狀不規(guī)則的脂褐素顆粒（圖1）。糖尿病大鼠組的細(xì)胞核不規(guī)則,有偽足伸出,核仁可見。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少:膜較清楚,腫脹變性,嵴斷裂、溶解,內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,核糖體有脫落現(xiàn)象;高爾基復(fù)合體成熟面腫脹;神經(jīng)原纖維數(shù)量增多,腫脹,體積增大（圖2）。

2.3 免疫組化結(jié)果

細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見染成棕黃色顆粒的結(jié)狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,認(rèn)定為表達(dá)陽性細(xì)胞。對照組大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)有散在的黃褐色顆粒,呈弱陽性反應(yīng);糖尿病大鼠組結(jié)狀神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃褐色塊狀物質(zhì),呈強(qiáng)陽性反應(yīng)（圖4）。bFGF平均積分光密度值（IDP）測定見表3。

圖1 正常對照組

圖2 糖尿病組

表3 對照組與糖尿病組bFGF的IDP值比較

圖3 正常對照組

圖4 糖尿病組

3 討論

本文采用免疫組化的方法觀察了大鼠結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元bFGF的表達(dá)以及分布情況。結(jié)果表明糖尿病組和正常對照組結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元胞漿中都有bFGF的表達(dá),但糖尿病大鼠組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于正常對照組（P＜0.01）;電子顯微鏡顯示糖尿病大鼠節(jié)狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元有損傷表現(xiàn),說明bFGF在糖尿病大鼠節(jié)狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中高表達(dá),可能對神經(jīng)元營養(yǎng)以及再生有作用。

神經(jīng)生長因子（NGF）是交感神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元和中樞神經(jīng)膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)元生長、發(fā)育、存活、維持功能所必須的營養(yǎng)因子[4]。NGF對效應(yīng)神經(jīng)元的作用主要有:①影響效應(yīng)神經(jīng)元的發(fā)育、分化過程;②維持成熟效應(yīng)神經(jīng)元正常功能;③參與成年動(dòng)物效應(yīng)神經(jīng)元損傷后的修復(fù)與再生[5]。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期,bFGF參與神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖和最初分化,并起到級(jí)聯(lián)控制過程。在神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)育成神經(jīng)元的過程中,首先受bFGF的作用,誘導(dǎo)NGF受體的表達(dá),并使細(xì)胞存活依賴于NGF。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),糖尿病神經(jīng)病變時(shí),確實(shí)存在神經(jīng)元的損傷。而糖尿病神經(jīng)病變時(shí),大多數(shù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NGF的水平是下調(diào)的,原因是NGF的生成是減少的以及NGF受體的功能是異常的[6]。因此我們是否可以推測,bFGF表達(dá)增強(qiáng)可能是因?yàn)镹GF的水平是下調(diào)導(dǎo)致的。

BFGF及其受體在周圍神經(jīng)的表達(dá)和損傷后變化的研究說明,與在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),內(nèi)源性bFGF表達(dá)增多同樣是外周神經(jīng)損傷后的早期反應(yīng)[11]。有些學(xué)者將bFGF應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)和神經(jīng)損傷模型等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)bFGF具有廣泛的促神經(jīng)再生作用,提示bFGF表達(dá)增多是神經(jīng)損傷后的修復(fù)反應(yīng),且可能具有始動(dòng)意義。而對于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),現(xiàn)在大部分學(xué)者集中于對神經(jīng)干的研究,本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)元的角度,利用bFGF在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)弱,探討了糖尿病時(shí)神經(jīng)病變,為糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。同時(shí),是否可根據(jù)bFGF在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá)程度的高低,來判斷糖尿病中神經(jīng)元損傷程度,進(jìn)一步判斷糖尿病神經(jīng)病變范圍,有待探討。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)位于迷走神經(jīng)干上的一個(gè)膨大,其中的神經(jīng)元為假單極神經(jīng)元,周圍突組成迷走神經(jīng)中的感覺纖維成分,主要分布于頭、頸、胸、腹腔臟器;中樞突向腦投射。本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)元的水平探討了糖尿病神經(jīng)病變的機(jī)制,那么神經(jīng)元的損傷是否會(huì)引起神經(jīng)干及其相連的效應(yīng)器或感受器的損傷,還是在糖尿病時(shí),三者是互相影響的,需要進(jìn)一步探討。

BFGF作為一種具有廣泛生物學(xué)活性的生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子,隨著bFGF研究的深入,可能給糖尿病神經(jīng)病變的發(fā)病機(jī)制提出新的問題,給治療帶來新的希望。

[1]杜文和,李芝應(yīng),林 平,等.糖尿病神經(jīng)病變發(fā)病的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39（2）:241.

[2]Zamburlin P,GilardinoA,A rianoP,et al.GDNF and bFGF are differentially involved in glial celldifferentiation and neurite bundle formation in cultures from chick embryonic ciliary ganglia[J].Neuroreport,2003,（18）:2343.

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[4]孫小單,李羽佳.神經(jīng)生長因子促神經(jīng)再生作用的研究進(jìn)展[J].遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31（4）:377.

[5]張海明,張 映.神經(jīng)生長因子對神經(jīng)元作用的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27（9）:39.

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