響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏總黃酮的提取工藝

秦俊哲， 郭云霞， 高存秀

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引 言

銀杏(GinkgobilobaL.)是銀杏科銀杏屬的唯一生存種植物[1],銀杏黃酮是銀杏葉主要有效成分之一，現(xiàn)已從銀杏葉中分離鑒定出40余種黃酮類化合物，國內(nèi)外大量研究證實(shí),銀杏黃酮具有抗氧化、降血脂、提高免疫力、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛等方面的作用[2,3]，銀杏黃酮的藥理作用已臨床應(yīng)用.本實(shí)驗(yàn)將響應(yīng)面分析應(yīng)用于銀杏黃酮的乙醇提取法，以銀杏黃酮得率為響應(yīng)值，采用多元二次回歸擬合出方程，得出最佳的提取條件.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料 市售銀杏茶，試劑 標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707)，無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純儀器 KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SP-752(PC)型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)

1.2 方法

表1 Box-Behnken因素水平表

1.2.1 測定方法[4]

準(zhǔn)確稱取一定標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁，70%乙醇溶解定容至50 mL，分別取0、1、2、3、4、5、6、7、8 mL加到25 mL容量瓶內(nèi)，加1 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻放置6 min,加1 mL 10%的硝酸鋁搖勻放置6 min,加入4 mL 4%的氫氧化鈉,然后用相應(yīng)的乙醇溶液定容，搖勻,靜置15 min.在400～600 nm波長范圍內(nèi)掃描得出最大吸收波長在510 nm，用最小二乘法將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度與所得吸光度值做一元線性回歸分析，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11.54C-0.001 2,R2=0.999 7.

1.2.2 銀杏黃酮的提取[5]

準(zhǔn)確稱取3.00 g銀杏茶粉末，料液比1∶30, 70%乙醇，70 ℃溫度下提取2.5 h,分別超聲波提取、微波提取、冷凝回流提取，過濾，冷卻定容，測定.

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面因素水平的設(shè)計(jì)及結(jié)果

對表2試驗(yàn)結(jié)果通過SAS軟件程序進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=1.072 33-0.045 375A-0.019 5B+0.011 875C-0.021 917A2-0.023 75A×B-0.007A×C-0.008 667B2-0.010 25B×C-0.016 917C2.

2.2 響應(yīng)面方差分析

由表3中可以看出，模型的F值為18.04，P值為0.002 7，P≤0.01，說明該模型具有高度顯著性；決定系數(shù)R2= 0.970 1，表明由此模型中可解釋97.01%的變異，說明此模型相關(guān)性良好；信噪比為13.922，表明該項(xiàng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)具有可行性，擬合度好.表3中決定系數(shù)A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取時(shí)間)、AB(乙醇濃度與料液比的交互作用)的P值分為0.000 2、0.007 5、0.046 0、0.013 5，P≤0.05，對銀杏黃酮得率的影響具有顯著性.

表3 回歸模型的方差分析表

注：決定系數(shù)R2= 0.970 1，Adeq Precision(信噪比)=13.922.

圖1 乙醇濃度與料液比對銀杏黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.3 響應(yīng)面分析

為了更直觀的表現(xiàn)兩個(gè)因素對銀杏黃酮得率的影響，以任意兩因素為考察對象，剩余因素水平取值為零，進(jìn)行降維分析，得到二元二次方程會(huì)出響應(yīng)面圖.本試驗(yàn)中顯著的交互影響是AB，即乙醇濃度與料液比的交互作用對銀杏黃酮得率的影響.

圖2 乙醇濃度與提取時(shí)間對銀杏黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖3 料液比與提取時(shí)間對銀杏黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等值線中的最小橢圓的中心點(diǎn).由圖1可知AB的交互作用顯著，在所選范圍內(nèi)，它們對Y值的影響規(guī)律隨著另一因素的改變有明顯變化；由圖2、3可看出，AC、BC交互作用不顯著，在所選范圍內(nèi)，它們對Y值的影響規(guī)律隨著另一因素的改變沒有有明顯變化.3個(gè)因素對Y值的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果吻合.由上述3組圖可知，該回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn).根據(jù)回歸方程，對A、B、C分別求偏導(dǎo)數(shù)，然后求解即得極大值點(diǎn)：乙醇濃度為80%，料液比為1∶39(g∶mL)，提取時(shí)間為2.8 h時(shí)銀杏黃酮得率達(dá)到最大值1.10%.驗(yàn)證試驗(yàn)得到實(shí)際銀杏黃酮得率為1.098%，與預(yù)測值比較吻合，說明回歸模型能夠真實(shí)地反映各因子對黃酮提取率的影響.

3 結(jié)束語

本試驗(yàn)采用醇提法，以乙醇溶液為提取劑提取銀杏總黃酮，并用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶38.97，提取時(shí)間為2.79 h.在此條件下，黃酮的得率為1.101%.此方法設(shè)備簡單、成本低、見效快，適于工業(yè)化生產(chǎn).

經(jīng)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化后，可以找到各因素的最佳值，并獲得較理想的得率，同時(shí)，各因素間的相互作用對生產(chǎn)過程中工藝參數(shù)的設(shè)置提供了參考，響應(yīng)面分析方法克服了傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)量較大，無法考慮各因素的綜合作用的缺點(diǎn)，對實(shí)際生產(chǎn)更有指導(dǎo)意義，在生產(chǎn)和科研中必將有更加廣闊的應(yīng)用前景.

參考文獻(xiàn)

[1] 夏曉暉,張 宇,郗硯彬.銀杏葉化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009,15(9):100-104.

[2] 陳易彬,張 益,劉 藝.不同的處理方法對提取銀杏葉黃酮含量的影響[J].中國釀造，2010,(2):82-84.

[3] 劉宗敏,張 慧,戴梓茹.銀杏黃酮的生理作用研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景[J].湖南林業(yè)科技,2006, 33(6):75-77.

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[5] 郭雪峰,岳永德. 黃酮類化合物的提取、分離純化和含量測定方法的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(26):8 083-8 086.