中國虎紋蛙種質資源研究進展*

田永斌， 夏明明， 邵 晨

(浙江師范大學生態(tài)學研究所，浙江金華 321004)

虎紋蛙(Hoplobatrachus rugulosus)曾廣泛分布于我國南方各省，由于其個體大、肉味鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種很好的食用蛙，多年來一直遭到過度捕捉，再加上生境退化及農藥濫用等因素的影響［1］，虎紋蛙的野生資源急劇減少．為了滿足市場需求及保護自然資源，人們開展了虎紋蛙的人工養(yǎng)殖，并取得了一定的成效．然而，目前虎紋蛙的人工養(yǎng)殖存在一些問題，對虎紋蛙種質資源質量存在著較大的隱患．

保護種質資源已經(jīng)成為當今世界一股強勁的潮流．為保護和持續(xù)利用種質資源，迫切要求種質標準的建立．本文從形態(tài)學水平、細胞學水平、生化和分子遺傳學水平等層面對虎紋蛙資源的研究狀況進行了總結與探討，并對虎紋蛙的養(yǎng)殖狀況及存在的問題進行了分析，為虎紋蛙種質標準、資源保護措施及持續(xù)發(fā)展我國虎紋蛙養(yǎng)殖業(yè)相關措施的制定與進一步研究提供參考資料．

1 中國虎紋蛙分類地位、分布及資源現(xiàn)狀

1．1 分類地位及分布

虎紋蛙，俗稱水雞、田雞、青雞、泥蛙、蝦蟆等，隸屬于脊索動物門(Chordata)脊椎動物亞門(Vertebrata)兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)叉舌蛙科(Dicroglossidae)虎紋蛙屬(Hoplobatrachus)．虎紋蛙屬約有 H．crassus，H．occipitalis，H．rugulosus和 H．tigerinus 4個(亞)種，中國和泰國各有1種，即中國虎紋蛙(H．rugulosus)和泰國虎紋蛙(H．occipitalis)．

中國虎紋蛙的分布范圍較廣，我國河南、陜西、四川、云南、貴州、湖北、安徽、江蘇、浙江、江西、湖南、福建、臺灣、廣東、海南、廣西和香港等地均有分布，國外還見于緬甸、泰國、越南和馬來西亞等地區(qū)［2］．

1．2 資源現(xiàn)狀

1989年，虎紋蛙被列為國家Ⅱ級保護動物，受到國家法律的保護，同時也是唯一列入國家重點保護野生動物名錄的蛙類;1996年，虎紋蛙被列入中國紅皮書等級;1997年，虎紋蛙被列入華盛頓公約(CITES)瀕危等級，附錄2;2003年，虎紋蛙又被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ珍稀瀕危物種名錄中;2004年，虎紋蛙被列入《中國物種紅色名錄》易危物種等級．

虎紋蛙曾廣泛分布于我國華東、華南、華中和西南等地區(qū)［3］，但近年來一部分地區(qū)已不見野生虎紋蛙的蹤影［4］．由于棲息地被破壞及過度捕捉，虎紋蛙野生資源遭到嚴重破壞，其數(shù)量正呈不斷下降的趨勢［5］．

目前，虎紋蛙分布范圍及種質資源不斷萎縮，資源狀況不明．所以，對不同地理種群現(xiàn)有虎紋蛙資源的野外調查，將會為科學評估虎紋蛙資源現(xiàn)狀，從而制定相應的保護措施提供寶貴信息;另外，也為進一步的虎紋蛙種質研究和資源利用積累豐富的材料．

2 虎紋蛙種質資源研究進展

2．1 形態(tài)學研究

形態(tài)學標記是傳統(tǒng)的研究物種差異的分類方法，主要是根據(jù)生物體形態(tài)特征的差異進行物種的劃分．

而虎紋蛙的形態(tài)學研究只有少數(shù)報道．邵晨等［6］對浙江金華繁殖期虎紋蛙的部分形態(tài)特征進行過簡單的描述;林植華等［7］對浙江麗水地區(qū)虎紋蛙的11個指標進行了測量，并對雌雄差異進行了研究分析，結果表明虎紋蛙頭長、四肢、眼徑、耳徑等特征存在一定的兩性異形現(xiàn)象，其中最顯著的兩性異形特征是體長．

形態(tài)學研究方法簡單直觀，容易觀察記錄，長期以來物種的分類及資源鑒定都是以形態(tài)標記為主要的或初步的指標．所以，對于中國虎紋蛙各地理種群的形態(tài)學研究還有待開展．但是，不同的學者選擇不同的形態(tài)指標進行測量分析，可能會導致對同一物種的分析結果不一致．而且，形態(tài)和表型特征易受環(huán)境條件、人為因素、測量工具及基因顯隱性等因素的影響，并不能完全真實全面地反映物種的遺傳多樣性．因此，要更加準確、細致地了解種群的遺傳變異狀況，還必須結合細胞、生化及分子水平等方面的分析和研究．

2．2 細胞遺傳學研究

細胞學標記主要是指染色體核型(染色體數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等)及帶型(C帶、G帶、N帶等)．其中染色體組型(核型)的研究是細胞遺傳學的基礎，是分類和系統(tǒng)發(fā)生研究較為有力的遺傳學證據(jù)，并具有物種的特異性．所以，一直以來關于無尾兩棲類細胞遺傳學研究的大部分集中于染色體組型的研究［8-14］．

我國關于虎紋蛙組型的研究主要集中在20世紀80年代．張維道［15-16］采用骨髓細胞滴片法和5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)對安徽蕪湖地區(qū)虎紋蛙的染色體組型進行了研究，并對虎紋蛙G-帶進行了初步分析，研究發(fā)現(xiàn):蕪湖產(chǎn)虎紋蛙二倍體染色體為26(2n=26)，包括5對大型染色體和8對小型染色體，其中包括8對中著絲粒染色體和5對亞中著絲粒染色體;在No．6，No．8的長臂和No．2的短臂上具有次縊痕．李樹深等［17］報道云南蒙自地區(qū)虎紋蛙核型是2n=26(22 M+4 SM)，可分為2大組:1～5對為A組，屬大型染色體;6～13對為B組，屬小型染色體;No．3和No．6為亞中央著絲點染色體，其余均為中央著絲點染色體;No．6的長臂近著絲點區(qū)域有次縊痕．章菊明等［18］、劉楚吾等［19］和方玲等［20］分別對浙江溫州地區(qū)、湖南漢壽地區(qū)和廣西南寧地區(qū)的虎紋蛙進行了染色體組型研究，與李樹森的分析結果相似．

文獻［21］指出，次縊痕的位置、數(shù)目和相對長度是染色體的分類特征之一．通過對上述學者對安徽蕪湖、云南蒙自、浙江溫州、湖南漢壽及廣西南寧5個地區(qū)虎紋蛙染色體組型的研究進行比較分析，我們發(fā)現(xiàn)各地理種群虎紋蛙染色體的相對長度、臂比指數(shù)、次縊痕的數(shù)目和分布及亞中著絲粒染色體的多少都存在一定的差異性．

另外，胡知淵等［22］應用Giemsa染色法對浙江金華地區(qū)棘胸蛙、虎紋蛙和黑斑蛙的血細胞進行了顯微觀察和各形態(tài)參數(shù)測定，結果表明紅細胞和白細胞的形態(tài)和數(shù)量比例有一定屬和種的特征．這表明將血細胞的研究作為種質鑒定的指標也是具有可行性的．

2．3 生化遺傳學研究

生化遺傳標記即基因產(chǎn)物標記，如血清蛋白、同工酶、等位酶等的標記．同工酶標記是一類新型的遺傳標記方法，實驗方法規(guī)范、簡便和快速，是一種較好的種質資源檢測方法．用于無尾兩棲類種質鑒定的生化遺傳標記多為同工酶標記［23-25］．

劉楚吾等［19］對湖南漢壽地區(qū)的牛蛙、黑斑蛙和虎紋蛙3種蛙的晶體、腦、心臟和肌肉4種組織的乳酸脫氫酶同工酶進行了研究，表明3種蛙存在著乳酸脫氫酶同工酶的組織特異性和種的特異性．范燕等［26］對虎紋蛙胚胎發(fā)育各階段的酯酶(EST)、蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)其不同生長階段的酶譜不完全相同．陳才法等［27］采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，研究并比較了采自安徽省六安市的虎紋蛙和江蘇省徐州市的金線蛙的腦、肝、心臟、骨骼肌4種組織的LDH同工酶，結果顯示LDH同工酶具有一定的組織特異性，并且在肝臟、心臟和骨骼肌中表現(xiàn)出一定的種間差異．

2．4 分子遺傳學研究

近些年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA分子標記技術已有數(shù)十種，用于種質鑒定的DNA標記方法的發(fā)展也極其迅速，主要有限制性內切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)標記、微衛(wèi)星 DNA(SSR)標記、隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)技術和線粒體DNA(mtDNA)標記等．有關無尾兩棲類的分子標記方法主要集中于mtDNA［28-29］，ISSR(inter-simple sequence repeat)［30］，RAPD［31］和SSR［32］等．

劉麗等［33-34］應用RAPD技術研究了中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的種內種間遺傳多樣性及種質特異性標記，指出:2種虎紋蛙的遺傳多樣性都比較豐富，但野生的中國虎紋蛙種群的遺傳多樣性還不如經(jīng)多代馴化和養(yǎng)殖的泰國虎紋蛙種群的豐富;并在基于RAPD的基礎上運用序列特異性擴增技術(SCAR)設計出鑒定2種虎紋蛙的分子標記，為中國虎紋蛙和泰國虎紋蛙的發(fā)展趨勢的監(jiān)測及品種的鑒定提供了理論依據(jù)．

黃建偉等［35］通過比較虎紋蛙、黑斑蛙、金線蛙、澤蛙、凹耳蛙和福建大頭蛙6種蛙的16 S rRNA的序列和二級空間結構，發(fā)現(xiàn)空間結構分析與序列比較結果存在一定的差異，虎紋蛙、黑斑蛙和澤蛙的二級結構相似，但與黑斑蛙同屬的金線蛙存在較大差異，凹耳蛙和福建大頭蛙與其他蛙類的二級結構差別較大，證實了二級結構也能作為系統(tǒng)發(fā)育的資料以確定進化關系．

3 虎紋蛙人工養(yǎng)殖及存在問題

為了滿足市場需求及保護自然資源，羅琛等［36］首次開展了虎紋蛙人工養(yǎng)殖的初步研究．隨后，許多學者對虎紋蛙人工養(yǎng)殖的相關技術進行了研究和探討，基本上解決了人工養(yǎng)殖［37-38］、人工繁殖與育苗［39-40］等一系列關鍵技術．

近幾年我國虎紋蛙養(yǎng)殖業(yè)在南方部分地區(qū)得到了較快發(fā)展，尤其是生態(tài)種養(yǎng)實驗取得了良好的經(jīng)濟、生態(tài)和社會效益．例如:黃志平［41-42］先后開展的水稻、虎紋蛙生態(tài)種養(yǎng)實驗和虎紋蛙、魚、林生態(tài)種養(yǎng)實驗;鐘傳明［43］對雜交虎紋蛙水稻種養(yǎng)技術的研究;吳建平［44］“水稻-虎紋蛙”生態(tài)農業(yè)模式的研究等，都取得了顯著的成果．

雖然虎紋蛙的人工養(yǎng)殖取得了一定的成功，減輕了對野外種群的壓力，但是還存在一些問題:

1)人工養(yǎng)殖至今沒有一個標準，缺乏人工選育的優(yōu)良品種，繁殖群體的選擇存在一定的盲目性．不少地方養(yǎng)殖場初始繁殖種群大都是收購或捕捉的野生種群．

2)品種交流存在一定的隨意性，人為虎紋蛙雜交現(xiàn)象嚴重．因目前未建立虎紋蛙苗種注冊制度，各地虎紋蛙的種苗都是流通的，導致各地品種交流頻繁，最終導致遺傳多樣性下降和種質退化．

3)引種憂患．1995年首次引進了外形酷似中國虎紋蛙的泰國虎紋蛙［45］，新品種的引進暫時緩解了市場供需矛盾，但是泰國虎紋蛙的早期胚胎發(fā)育所需時間比中國虎紋蛙少22．1 h［46］，也就是胚胎發(fā)育階段泰國虎紋蛙比中國虎紋蛙生長快．并且，與中國虎紋蛙相比，泰國虎紋蛙的遺傳多樣性豐富、環(huán)境適應能力強．由于泰國虎紋蛙與中國虎紋蛙競爭相同的生態(tài)位，所以繁殖能力和適應能力強的泰國虎紋蛙很有可能完全侵占中國虎紋蛙的生態(tài)位，從而使中國虎紋蛙處于更加瀕危的境地［33］．有調查發(fā)現(xiàn)，在市場價格比較低或養(yǎng)殖池中出現(xiàn)病蛙時，蛙農就放棄養(yǎng)殖，將泰國虎紋蛙成池地隨意放到周邊自然環(huán)境中［47］，可能導致中國野生虎紋蛙個體基因組成的改變，使得原種種質資源遭到污染，生存受到威脅．

4 虎紋蛙種質資源保護建議

目前，對于虎紋蛙種質資源的保護和研究已刻不容緩．根據(jù)以上所述內容，我們建議對虎紋蛙種質資源的保護應做好以下方面的工作:

1)從虎紋蛙的資源現(xiàn)狀來看，必須大力保護野生虎紋蛙的棲息地，明確現(xiàn)有資源現(xiàn)狀并進行科學評價;對非法捕殺、販賣野生個體的行為進行嚴厲打擊;通過媒體加大保護野生個體的宣傳力度;加強和健全保護區(qū)的管理制度．另外，對于一些具有代表性的種群或數(shù)量很少的種群，可以進行遷地保護．

2)從種質資源研究現(xiàn)狀來看，有關虎紋蛙從種質角度進行的研究還較少．保護虎紋蛙種質資源就是保護虎紋蛙的遺傳多樣性．我們建議從形態(tài)水平、細胞水平、生化水平和分子水平等層面對本地種群的種質進行全面系統(tǒng)的研究，建立虎紋蛙種質標準;通過對各地理種群的研究，建立和完善虎紋蛙種質資源數(shù)據(jù)庫．旨在為種質資源評價、保護和合理利用及后續(xù)的良種選育提供基礎資料．

3)從人工養(yǎng)殖現(xiàn)狀及存在的問題來看，為避免虎紋蛙種質受污染，保持種質的純潔性，必須加強中國虎紋蛙的原種鑒定、保存及優(yōu)良品種的選育;建立原、良種場，避免不必要的近交和近交衰退;規(guī)范苗種生產(chǎn)、銷售行為，向社會提供優(yōu)質的種苗;養(yǎng)殖場引種時要清楚種苗的遺傳背景，不能為了追求經(jīng)濟利益而盲目引種．

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