真菌GXM生物學(xué)活性及影響因素的研究進(jìn)展

聶建巍 楊蓉婭

(1.北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚病診治中心，北京 100125;2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 230032)

GXM(glucuronoxylomannan)即葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖。目前研究發(fā)現(xiàn)GXM僅存在于毛孢子菌的細(xì)胞壁和新生隱球菌的莢膜中，尚未在其他真菌中發(fā)現(xiàn)。GXM是阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁的重要成分，也是重要的代謝產(chǎn)物，是真菌生長時(shí)脫落到培養(yǎng)基質(zhì)中的分泌性多糖［1］。GXM是新生隱球菌莢膜中含量最高的多糖，占莢膜成分的90%以上［2］。GXM是高分子量的多糖，具有抗原性，由6種不同的重復(fù)多糖單位組成的乙?；木€性多糖，其主要成分是甘露糖三糖基序，含有一個(gè)β(1，2)葡萄糖醛酸基團(tuán)和不同含量的β(1，2)、β(1，4)吡喃木糖。患者在抗真菌治療成功之后，仍然可以用ELISA法檢測到GXM抗原［3］。

1 GXM的生物學(xué)活性

1.1 毒力與致病性

新生隱球菌主要侵犯人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在感染隱球菌患者的腦脊液中可以檢測到GXM，但因隱球菌屬莢膜多糖與毛孢子菌屬細(xì)胞壁成分有交叉反應(yīng)性［4］，應(yīng)注意兩者的鑒別。GXM是重要的毒力因子，McFadden等［5］在研究新生隱球菌的結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)GXM是以共聚合的方式形成的，GXM的生化組成和乙?；癄顟B(tài)可以隨著代謝狀態(tài)和環(huán)境的變化而改變，產(chǎn)生多種多樣的莢膜多糖分子，從而改變抗原性。而抗原性的改變有利于逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別和殺傷，對(duì)于隱球菌在宿主體內(nèi)的存活非常重要，GXM分子的多樣性也與毒力有著密切的聯(lián)系［6］。

Vecchiarelli［7］在研究新生隱球菌患者的血清和腦脊液時(shí)檢測到高水平的莢膜多糖抗原。GXM之所以被認(rèn)為是莢膜多糖的主要致病因子，是因?yàn)樵诨颊吒腥酒陂g莢膜多糖GXM被釋放到組織中廣泛累積，宿主缺乏對(duì)莢膜多糖的反應(yīng)性等，最終引起相應(yīng)部位的毒性反應(yīng)［8］。

1.2 免疫活性

GXM可以干擾抗原提呈細(xì)胞、白細(xì)胞的募集，抑制宿主的免疫、炎癥反應(yīng)，逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的殺傷［9］。

誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡 目前研究表明具有抗真菌感染的 Toll樣受體 (TLR)主要為 TLR2和TLR4。Yauch［10］等對(duì)各種 TOLL 樣受體的作用進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR2參與對(duì)酵母聚糖的識(shí)別與吞噬。GXM經(jīng)TLR4與CD14的識(shí)別后可激活NF-кB的轉(zhuǎn)錄;GXM與TLR4結(jié)合，可上調(diào)巨噬細(xì)胞表面的Fas配體，誘導(dǎo)Fas的表達(dá)和Jurkat T細(xì)胞的凋亡。

抑制T細(xì)胞活化、增殖 Monari等［11］通過對(duì)抗CD3抗體、刀豆蛋白A的研究發(fā)現(xiàn)GXM直接抑制T細(xì)胞的增殖。樹突狀細(xì)胞 (Dendritic cells，DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力，成熟DC可以高表達(dá)MHCⅠ類和MHCⅡ類分子、CD80、CD40等，有效激活初始型T細(xì)胞，其中MHCⅡ分子可以與抗原肽結(jié)合并提呈給T細(xì)胞。但有莢膜的菌株不能激發(fā)樹突狀細(xì)胞Ⅰ類、Ⅱ類和CD83分子的表達(dá)，可溶性的GXM莢膜多糖不能激發(fā)樹突狀細(xì)胞MHCⅠ類、Ⅱ類分子的表達(dá)，兩者皆能干擾DC的成熟、活化，且GXM能限制抗原肽與T細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制了T細(xì)胞的增殖、活化［12-13］。

抑制單核細(xì)胞分泌致炎因子 Monari等［14］在感染新生隱球菌患者的體液中發(fā)現(xiàn)，GXM可以誘導(dǎo)分泌TNF-α、IL-10，從而產(chǎn)生免疫抑制作用;GXM下調(diào)IL-12的生成，引起IFN-γ等Th1細(xì)胞因子減少，從而抑制保護(hù)性的Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

1.3 抗吞噬性

新生隱球菌莢膜中的GXM成分可以干擾補(bǔ)體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)菌體的吞噬過程，從而起到抵抗吞噬的作用［15］。Rodrigues 等［16］在研究新生隱球菌的莢膜時(shí)發(fā)現(xiàn)無莢膜的突變株比有莢膜的野生株毒性弱，新生隱球菌突變株本身對(duì)GXM的分泌是有缺陷的，但是當(dāng)新生隱球菌的突變株在阿薩希毛孢子菌的上清液中培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)新生隱球菌的莢膜突變體包被上了阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁分泌的GXM，顯示了阿薩希毛孢子菌有與新生隱球菌野生株相似的抵抗巨噬細(xì)胞吞噬的特性。然而，GXM保護(hù)毛孢子菌細(xì)胞抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬尚未得到證明。

1.4 合成與轉(zhuǎn)運(yùn)

新生隱球菌的莢膜多糖是在細(xì)胞內(nèi)的高爾基體內(nèi)合成的［17］。Rodrigues等［15］研究表明新生隱球菌莢膜中的GXM也是在高爾基體中合成，然后包裝成小囊泡，這些小囊泡脫離細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞外間隙，GXM在細(xì)胞外間隙參與莢膜的形成或者是被運(yùn)送到宿主細(xì)胞、組織中。Oliveira等［18］在研究多糖的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)現(xiàn)，GXM與細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外間隙的膜相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)——脂質(zhì)直接相關(guān)。

2 影響GXM形成的因素

2.1 物理因素

二價(jià)金屬離子 GXM聚合物表面的葡萄糖殘基所帶的負(fù)電荷與二價(jià)金屬離子之間的相互作用形成交聯(lián)橋。當(dāng)GXM在不同濃度的Ca2+、Mg2+鹽酸鹽溶液中培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些金屬離子結(jié)合到多糖上的能力與自身的數(shù)量呈劑量依賴性關(guān)系。隱球菌用Ca2+、Mg2+鹽酸鹽處理后，隨著二價(jià)金屬離子含量的增多，GXM表面的負(fù)電荷逐漸降低，證實(shí)了二價(jià)金屬離子是結(jié)合到帶負(fù)電荷的多糖上的。Nimrichter等［19］在研究新生隱球菌的莢膜多糖時(shí)發(fā)現(xiàn)莢膜的擴(kuò)大在培養(yǎng)基中受Ca2+的影響，莢膜的聚集實(shí)質(zhì)上是細(xì)胞外的GXM分子由二價(jià)陽離子介導(dǎo)的自我聚集，Ca2+可以調(diào)節(jié)GXM的自我聚集能力。用氯化鈣處理后的結(jié)果顯示Ca2+濃度在0.000 1～0.1 mmol/L時(shí)莢膜多糖的黏度增加，當(dāng)濃度在0.1～10 mmol/L時(shí)莢膜多糖黏度降低，具體機(jī)制尚不清楚。

溫度、時(shí)間、培養(yǎng)介質(zhì) 在不同情況下阿薩希毛孢子菌產(chǎn)生GXM的能力是不同的，F(xiàn)onseca等［4］在研究阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁和胞外分泌的GXM時(shí)發(fā)現(xiàn)，37℃生長條件下其表達(dá)下調(diào)。由于人類正常體溫在37℃左右，所以阿薩希毛孢子菌與新生隱球菌相比，前者的發(fā)生率比較低。Diane等［20］在37℃人血清中培養(yǎng)4周后發(fā)現(xiàn)，GXM失去了91%的反應(yīng)活性;45℃培養(yǎng)4周后喪失了99%的反應(yīng)活性。分別在37℃和45℃培養(yǎng)4周后用乳膠凝集法測得GXM的滴度下降。在37℃培養(yǎng)4周后，磷酸鹽緩沖液 (PBS)、胎牛血清 (FBS)中的GXM的反應(yīng)活性差異并不顯著，但是在水中的活性較前兩者降低;在45℃培養(yǎng)4周后，GXM的反應(yīng)性在PBS、FBS、水中依次降低。

2.2 化學(xué)因素

二甲亞砜 McFadden［5］等用二甲亞砜處理阿薩希毛孢子菌細(xì)胞壁后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁變得不穩(wěn)定。二甲亞砜處理的阿薩希毛孢子菌沒有被抗GXM的抗體識(shí)別，解釋此結(jié)果可能是因?yàn)镚XM抗原釋放出來并發(fā)生解離，而不是缺乏對(duì)抗體的反應(yīng)性，因?yàn)槎讈嗧刻幚淼纳锨逡航?jīng)過透析、純化后仍然可以被可溶性抗-GXM的單克隆抗體MAb18B7識(shí)別。新生隱球菌與DMSO共同孵育后發(fā)現(xiàn)GXM比例大大減少，與此同時(shí)莢膜體積降至 (65±8)μm3，而未用DMSO處理的莢膜體積則為 (1 276±95)μm3［21］。

幾丁質(zhì)酶 幾丁質(zhì)酶是重要的水解酶，它可以降解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)。Fonseca等［4］用幾丁質(zhì)酶處理阿薩希毛孢子菌的細(xì)胞壁后發(fā)現(xiàn)，GXM從細(xì)胞壁中釋放出來，隨著幾丁質(zhì)酶劑量的增加，GXM釋放也增加。在PBS中孵育阿薩希毛孢子菌后取上清液作為對(duì)照，在相同的緩沖液中加入幾丁質(zhì)酶作為實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組阿薩希毛孢子菌上清液中釋放的GXM顯著增多。Rodrigues等［22］用幾丁質(zhì)酶處理新生隱球菌細(xì)胞壁后發(fā)現(xiàn)結(jié)果與阿薩希毛孢子菌相似，莢膜中GXM的釋放呈劑量依賴性。GXM從細(xì)胞壁中釋放出來，莢膜體積減小與GXM釋放呈正相關(guān)。

2.3 菌株與表現(xiàn)型

Karashima等［23］在培養(yǎng)阿薩希毛孢子菌臨床株時(shí)發(fā)現(xiàn)，其上清液中釋放的GXM抗原顯著高于環(huán)境株中釋放的GXM抗原，所以臨床株GXM的抗原滴度比環(huán)境株的GXM抗原滴度要高。與原代的環(huán)境株相比，在所有的傳代菌株中GXM抗原滴度顯著增高。Fries等［24］發(fā)現(xiàn)減毒的新生隱球菌24067A株存在三種表現(xiàn)型:皺褶型菌落 (WR)、平滑型菌落(SM)、假菌絲狀菌落 (PH)。三者毒力依次為:WR＞PH＞SM，產(chǎn)生的GXM滴度依次為:WR＞PH＞SM。

3 展 望

真菌的毒力和發(fā)病機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)問題。GXM與真菌的致病性密切相關(guān)。目前GXM單克隆抗體正處于臨床試驗(yàn)階段，治療性的GXM單克隆抗體將成為抵抗致病性真菌感染的有利武器?？扇苄缘腉XM單克隆抗體通過形成抗原-抗體復(fù)合物被網(wǎng)狀內(nèi)皮吸收，腦脊液和血清中的GXM水平明顯降低［25］。深入研究GXM可以為真菌的致病性提供更加可靠的理論依據(jù)。另外，GXM有助于了解疾病的進(jìn)展、治療后的反應(yīng)及預(yù)后情況。本文通過對(duì)真菌GXM的生物學(xué)活性以及影響因素的總結(jié)，以期更好的了解和分析GXM的毒力及發(fā)病機(jī)制，為控制真菌感染和疾病治療提供更多的研究依據(jù)。

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