舍曲林抗新生隱球菌的體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

周南 黃晨 潘煒華 廖萬(wàn)清

(第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚病真菌病研究所上海市醫(yī)學(xué)真菌分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室全軍真菌病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200003)

新生隱球菌是一種嚴(yán)重危害人類健康的醫(yī)學(xué)真菌，它不僅侵犯免疫缺陷患者，也常感染正常人群。近年來(lái)，由于免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素、抗生素的廣泛應(yīng)用、器官移植、靜脈插管和體內(nèi)植入人工物等侵襲性診療技術(shù)的推廣應(yīng)用以及艾滋病患者的增多，隱球菌感染率不斷增高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，非洲AIDS患者中隱球菌病的發(fā)生率高達(dá)30%，美國(guó)約6% ～10%［1］。隱球菌可侵犯全身各臟器，但以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為常見，臨床主要表現(xiàn)為亞急性或慢性腦膜炎、腦膜腦炎，少數(shù)可表現(xiàn)為顱內(nèi)占位性病變。其病情重，治療困難，病死率高［2］。

雖然目前多種藥物已廣泛應(yīng)用于隱球菌感染的臨床治療，但仍各有優(yōu)缺點(diǎn)，如藥物不良反應(yīng)突出，在腦脊液中的濃度偏低等，因此需要探尋新的、更成熟的抗隱球菌藥物［3］。

舍曲林是最強(qiáng)的選擇性5-羥色胺攝取抑制劑之一［4］，主要用于各種抑郁癥及強(qiáng)迫癥［5］，是目前廣泛使用的治療嚴(yán)重月經(jīng)前期綜合癥的一線用藥［6］。2001 年奧地利學(xué)者Lass-Flrl C 首次發(fā)現(xiàn)了舍曲林的抗白念珠菌作用，3位同時(shí)患有月經(jīng)前期焦慮障礙和復(fù)發(fā)性陰道念珠菌病的患者接受舍曲林的治療后，復(fù)發(fā)性陰道念珠菌病沒有再次發(fā)生，同時(shí)該研究小組對(duì)念株菌屬的不同種及曲霉屬的不同種進(jìn)行了體外藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明舍曲林有快速有效的抗真菌作用［7-8］。

本研究通過(guò)體外藥敏實(shí)驗(yàn)，觀察舍曲林對(duì)新生隱球菌的敏感試驗(yàn);同時(shí)構(gòu)建新生隱球菌感染的小鼠模型，探討舍曲林對(duì)隱球菌感染的治療效果。

1 材料與方法

1.1 體外實(shí)驗(yàn)

材料 菌株 新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株H99來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)真菌保藏管理中心隱球菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。

藥物 舍曲林標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)體購(gòu)自SIGMA公司，純度大于99.9%;氟康唑原粉由西安楊森制藥有限公司提供，純度大于99%。

培養(yǎng)基 酵母浸膏(YEPD)液體和固體培養(yǎng)基，RPMI-1640液體培養(yǎng)基 (Life Technologies InC，NY.14072 Osa.)。

主要試劑和器材 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、麥?zhǔn)媳葷峁?、血?xì)胞計(jì)數(shù)板均購(gòu)自上海求精生化試劑儀器有限公司;0.5 ～20 μL、10 ～100 μL 微量加樣器(大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司，中國(guó))，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，中國(guó))，分析天平 (DT-100A，天津市精科材料試驗(yàn)機(jī)廠，中國(guó))，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司，日本);無(wú)菌試管、水、真菌培養(yǎng)平皿均購(gòu)自江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;涂棒，棉簽，生理鹽水。

方法菌株的活化 保存菌株復(fù)溫后，使用YEPD液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)箱30℃180 r/min培養(yǎng)24 h活化。

菌懸液的配制 將活化后的菌株轉(zhuǎn)種于YEPD培養(yǎng)基平皿，30℃培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落于RPMI-1640培養(yǎng)基，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液濃度為5×103/mL，將調(diào)整后的菌懸液再次接種YEPD平皿培養(yǎng)基并確證菌懸液濃度。

實(shí)驗(yàn)分組 共分成6組，每組4根試管，每根試管加有上述濃度的菌懸液1 mL。組1:菌懸液中加入10 μL生理鹽水作為空白對(duì)照組。組2:菌懸液中加入10 mg/mL氟康唑10 μL。組3:菌懸液中加入10 mg/mL舍曲林10 μL。組4:菌懸液中加入20 mg/mL舍曲林10 μL。組5:菌懸液中加入10 mg/mL氟康唑及10 mg/mL舍曲林各10 μL。組6:菌懸液中加入10 mg/mL氟康唑及20 mg/mL舍曲林各 10 μL。

培養(yǎng)方法將加入抗菌素的菌懸液分別全部轉(zhuǎn)入YEPD固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落計(jì)數(shù)。

1.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

材料 菌株及藥物 同實(shí)驗(yàn)1.1。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)BALBc小鼠(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重為 (18±2)g，雌性。

方法新生隱球菌菌懸液的制備 保存菌株復(fù)溫后，使用YEPD液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)箱30℃180 r/min培養(yǎng)24 h活化;將活化后的菌株轉(zhuǎn)種于YEPD培養(yǎng)基平皿，30℃培養(yǎng)48 h后，挑選單個(gè)菌落于1 mL生理鹽水中，調(diào)節(jié)菌懸液濃度至1×106CFU/mL。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及方法鼠齡6～8周的雌性BALBc小鼠75 只，經(jīng)尾靜脈注射［9］0.1 mL 上述新生隱球菌菌懸液。實(shí)驗(yàn)共分6組。組1(n=15):新生隱球菌小鼠模型制備后1～5 d予以生理鹽水10 mg/kg灌胃。組2(n=10):新生隱球菌小鼠模型制備后1～5 d予以氟康唑10 mg/kg灌胃。組3(n=15):新生隱球菌小鼠模型制備前1～5 d以及后1～5 d予以舍曲林10 mg/kg灌胃。組4(n=15):新生隱球菌小鼠模型制備前1～5 d以及后1～5 d予以舍曲林20 mg/kg灌胃。組5(n=10):新生隱球菌小鼠模型制備前1～5 d予以舍曲林10 mg/kg灌胃，模型制備后1～5 d予以舍曲林10 mg/kg和氟康唑10 mg/kg灌胃。組6(n=10):新生隱球菌小鼠模型制備前1～5 d予以舍曲林20 mg/kg灌胃，模型制備后1～5 d予以舍曲林20 mg/kg和氟康唑10 mg/kg灌胃。于模型制備后第1 d組1、組3、組4各處死5只小鼠;于模型制備后第3、5 d 組1、組2、組3、組4、組5、組6 各處死5只小鼠。小鼠處死后取腦組織和肺組織，研磨，稀釋，取研磨液涂布于YEPD培養(yǎng)基，行菌落計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果均以(±s)表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)各組數(shù)據(jù)行方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)2 d后對(duì)各組培養(yǎng)基進(jìn)行新生隱球菌計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)舍曲林與氟康唑聯(lián)合用藥明顯抑制新生隱球菌的生長(zhǎng)。不同濃度的舍曲林皆可有效抑制新生隱球菌;但10 mg/mL舍曲林的抗菌效果較氟康唑差 (P＜0.01)，20 mg/mL舍曲林的抑菌效果與氟康唑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。

表1 新生隱球菌菌懸液體外培養(yǎng)3 d后菌落數(shù)(CFU)Tab.1 Colony numbers of Cryptococcus neoformans in suspension solution after 3-day culture in vitro

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

予以BALBc小鼠尾靜脈注射0.1 mL新生隱球菌菌懸液后第1 d、3 d、5 d，其腦組織及肺組織研磨液培養(yǎng)后新生隱球菌菌落數(shù)呈進(jìn)行性升高，說(shuō)明新生隱球菌動(dòng)物模型制備成功。予以灌胃處理10 mg/kg或20 mg/kg劑量的舍曲林可明顯降低新生隱球菌模型小鼠第1 d腦組織及肺組織的研磨液培養(yǎng)后的新生隱球菌菌落數(shù) (P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度舍曲林對(duì)感染小鼠腦組織研磨液培養(yǎng)后的新生隱球菌菌落數(shù)影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＞0.05)，高濃度舍曲林對(duì)菌落計(jì)數(shù)的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.05)，不同濃度的舍曲林都可有效的抑制肺組織新生隱球菌菌落數(shù)(P＜0.05)。腦組織及肺組織中，舍曲林治療對(duì)新生隱球菌的抗菌效果均不如氟康唑，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。舍曲林與氟康唑聯(lián)合治療對(duì)新生隱球菌模型小鼠肺組織的抗菌效果較單獨(dú)藥物的效果要強(qiáng) (P＜0.05)。見表2～4。

3 討 論

舍曲林是最強(qiáng)的選擇性5-羥色胺攝取抑制劑之一，主要用于各種抑郁癥及強(qiáng)迫癥，其主要的藥理作用機(jī)制是通過(guò)選擇性抑制中樞神經(jīng)元對(duì)5-羥色胺(5-HT)的再攝取，增加突觸部位有效5-HT的濃度，從而增強(qiáng)5-HT能神經(jīng)興奮傳導(dǎo)效力。舍曲林的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，其在正常人體內(nèi)吸收緩慢，血藥濃度達(dá)峰時(shí)間 (Tmax)為6～8 h，生物利用度為88%，半衰期約為24 h［10］，生物利用度不受食物和給藥時(shí)間的影響，血漿蛋白結(jié)合率高，舍曲林主要在肝臟代謝，不足0.2%以原形隨尿排出。舍曲林具有線性的藥代動(dòng)力學(xué)特征［11-13］，在臨床相應(yīng)的50～200 mg/d劑量?jī)?nèi)的固定治療劑量研究表明，50 mg/d舍曲林治療是最佳治療方案［14］。與其他抗真菌藥物比較，舍曲林在腦脊液中的濃度更高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)同期血漿中的濃度(約大于40倍)，而且更高的濃度也利于其抗真菌作用的發(fā)揮［10］，由于舍曲林在血液中達(dá)到有效抑菌濃度的時(shí)間較氟康唑長(zhǎng)，因此本研究中在新生隱球菌模型制備前即開始給予舍曲林治療。我們研究發(fā)現(xiàn)在制備新生隱球菌模型之前預(yù)先給予舍曲林預(yù)防治療，可明顯減少第1 d腦組織及肺組織的新生隱球菌菌落數(shù)，且在腦組織中，增加舍曲林的劑量其抑菌效果增強(qiáng)。

表2 新生隱球菌模型第1天小鼠腦組織和肺組織培養(yǎng)后菌落數(shù)(CFU)Tab.2 Colony numbers of Cryptococcus neoformans in lung and brain tissue culture on day 1 after model establishment

本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)舍曲林可有效抑制新生隱球菌菌落數(shù)量，具有較強(qiáng)的抗新生隱球菌作用。2003年該研究小組又報(bào)道了舍曲林可以顯著影響白念珠菌的菌絲延長(zhǎng)、磷脂酶活性、分泌性天冬氨酸蛋白水解酶的產(chǎn)生以及真菌的活性等，而且巨噬細(xì)胞在舍曲林的作用下可以更好地降低孢子萌發(fā)率，從而推測(cè)舍曲林可以降低白念珠菌等真菌病原體在體內(nèi)的毒性［15］。本研究的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，在肺組織中低劑量或高劑量舍曲林治療均可有效抑制新生隱球菌模型制備后1～5 d的隱球菌生長(zhǎng)，低劑量組與高劑量組之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其抑菌效果不如氟康唑治療組;在腦組織中，給予高劑量舍曲林可有效抑制隱球菌的生長(zhǎng)，但其抑菌效果較氟康唑差。

表3 新生隱球菌模型第3天小鼠腦組織和肺組織培養(yǎng)后菌落數(shù)(CFU)Tab.3 Colony numbers of Cryptococcus neoformans in lung and brain tissue culture on day 3 after model establishment

表4 新生隱球菌模型第5天小鼠腦組織和肺組織培養(yǎng)后菌落數(shù)(CFU)Tab.4 Colony numbers of Cryptococcus neoformans in lung and brain tissue culture on day 5 after model establishment

唑類藥物與細(xì)胞色素P450類固醇合成酶結(jié)合，抑制該酶的催化活性，從而抑制麥角類固醇的生成，有研究表明，舍曲林和伊曲康唑或兩性霉素B的聯(lián)合用藥可以對(duì)某些曲霉起到協(xié)同作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)舍曲林與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用與單藥治療比較抑制新生隱球菌的生長(zhǎng)的效果更顯著。

綜上所述，舍曲林具有抗新生隱球菌作用，尤其是與氟康唑聯(lián)合治療時(shí)可起到協(xié)同作用，但舍曲林抗真菌的作用機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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