乳源過敏及低致敏乳制品的研究

胡長利，陳歷俊，宋小紅，盧陽

（北京三元食品股份有限公司技術(shù)中心，北京100085）

乳源過敏及低致敏乳制品的研究

胡長利，陳歷俊，宋小紅，盧陽

（北京三元食品股份有限公司技術(shù)中心，北京100085）

對(duì)牛乳蛋白過敏原、牛乳蛋白的改性進(jìn)行了闡述，并分析了加工過程對(duì)牛乳蛋白過敏原的影響，綜述了當(dāng)前國內(nèi)外低致敏性乳制品的研究開發(fā)現(xiàn)狀。

牛乳；蛋白過敏；改性

0 引言

牛乳含有多種蛋白質(zhì)，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品，但也是較易引起過敏的食物之一。嬰兒及兒童的牛乳過敏發(fā)生率為2%～6%，成人的發(fā)生率則較小，為0.1%～0.5%。絕大多數(shù)的牛乳蛋白都具有潛在的致敏性，但目前普遍認(rèn)為酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LG)及α-乳白蛋白(α-LA)是主要的過敏原，而牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(LGS)及乳鐵蛋白(Lf)是次要過敏原[1]。

在嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)研究中，研究者最早引入了低致敏性的水解牛乳蛋白或者水解大豆蛋白來改善或者降低牛乳潛在的過敏危害。近年來，針對(duì)兒童市場(chǎng)推出的各種兒童牛奶逐步被消費(fèi)者所接受，這無疑會(huì)增加兒童食用牛奶而導(dǎo)致過敏的潛在風(fēng)險(xiǎn)。加強(qiáng)對(duì)牛奶過敏原的了解，熟悉牛奶加工過程中過敏性蛋白的變化以及開發(fā)低致敏性的兒童牛奶是未來兒童乳品市場(chǎng)發(fā)展的重中之重，本文就此進(jìn)行深入闡述。

1 牛乳中乳蛋白過敏原概述

1.1 主要牛乳蛋白過敏原

牛乳中酪蛋白、β-LG、α-LA是最主要的過敏原，其中約82%的牛乳過敏病人都對(duì)β-LG過敏。乳蛋白之所以成為過敏原是因?yàn)槠渚哂羞^敏表位。乳蛋白的表位有2種：構(gòu)象表位和線性表位。構(gòu)象表位的活性依賴于構(gòu)象，線性表位則是氨基酸序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)。不同構(gòu)象特征和表位影響著乳蛋白過敏原的特征[2]。

1.1.1 酪蛋白過敏原

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)，主要分為αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。大部分對(duì)酪蛋白過敏的病人對(duì)這4種酪蛋白都過敏。酪蛋白與血清IgE反應(yīng)的強(qiáng)弱程度差異較大，且與乳中4種酪蛋白的比例相關(guān)。這4種酪蛋白都是磷酸化的蛋白，分子中那些大量磷酸化殘基的酸性肽鏈對(duì)蛋白的致敏性及不同酪蛋白間的交叉反應(yīng)起重要作用。酪蛋白分子通過疏水相互作用形成非剛性的“random coi”三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)松散易變，易被蛋白酶破壞，因而被認(rèn)為具有較弱的致敏性。但酪蛋白在牛乳中含量較高且有較多的線性表位，仍然是一種主要過敏原[3]。

1.1.2 β-LG過敏原

β-LG是牛乳乳清中的主要蛋白質(zhì)，約占牛乳總蛋白的10%，研究發(fā)現(xiàn)不存在于母乳中。β-LG是高度結(jié)構(gòu)化的蛋白質(zhì)，有7%～10%的α-螺旋，43%～51%的β-折疊，耐酸和耐蛋白酶水解，胃蛋白酶不能將其水解，因此消化后人體內(nèi)還存在著完整的β-LG，可能會(huì)引起過敏反應(yīng)[4]。

1.1.3 α-LA過敏原

α-LA屬于溶菌酶家族的蛋白，含有123個(gè)氨基酸殘基，4個(gè)二硫鍵。α-LA的氨基酸序列與人乳α-LA的氨基酸序列有高度的一致性，然而仍然是主要的乳蛋白過敏原，這說明三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)α-LA的過敏原性具有重要作用。α-LA有N型構(gòu)象（天然構(gòu)象）和A型構(gòu)象（酸構(gòu)象）；當(dāng)pH＜5時(shí)，N型向A型轉(zhuǎn)移，在乳的正常pH值（6.6～6.8）時(shí)，呈N型構(gòu)象[5]。

1.2 牛乳蛋白過敏原的改性

目前，通過蛋白質(zhì)改性技術(shù)，對(duì)牛乳蛋白質(zhì)進(jìn)行改性是研究熱點(diǎn)。所謂蛋白質(zhì)改性，就是用生化因素(如化學(xué)試、酶制劑等)或物理因素(如熱、射線等)使其氨基酸殘基和多肽鏈發(fā)生某種變化，引起蛋白質(zhì)大分子空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的改變，從而消除或者降低牛乳的過敏性，獲得較好功能特性和營養(yǎng)特性蛋白質(zhì)。

1.2.1 熱處理改性

熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間共價(jià)或非共價(jià)的相互作用，生成聚合物。這種熱誘導(dǎo)性聚合物在一定程度上將過敏蛋白原的抗原決定部位掩蓋，降低了過敏性。通常55～70℃時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞；70～80℃時(shí)S-S鍵斷裂，分子內(nèi)分子間發(fā)生新的相互作用；80～90℃時(shí)二硫鍵重排；90～100℃時(shí)β-LG通過S-S鍵與κ-酪蛋白鍵連接形成聚合物，然后形成凝膠，蛋白質(zhì)表面特性改變，表面積增大。熱處理后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的性質(zhì)和程度取決于熱處理的溫度和時(shí)間，蛋白質(zhì)的內(nèi)在性質(zhì)和物化條件(如pH)對(duì)其也有影響[6]。

1.2.2 糖基化作用改性

將碳水化合物以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)分子上的氨基(主要為Lys的ε-氨基)或羧基相結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)(包括美拉德反應(yīng))，稱之為蛋白質(zhì)的糖基化作用，這種方法也被廣泛的用來降低乳蛋白的抗原性，提高乳蛋白質(zhì)的功能特性。

聚乙烯乙二醇及其衍生物(PEGs)與蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)在溫和的條件下進(jìn)行，PEGs易與蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生膠聯(lián)，PEGs可中和乳蛋白表面電荷，結(jié)合了PEGs的乳蛋白的抗原性明顯降低，甚至完全消除。

羧甲基葡聚糖(CMD)是一種理想的抗原決定部位的屏蔽物。將CMD結(jié)合在β-LG上，形成的β-LGCMD具有高熱穩(wěn)定性，無過敏性，能保持結(jié)合維生素E的活性。另外，以葡萄糖胺(GLCN)、殼聚戊糖(CPO)和殼聚糖(CHS)、海藻酸寡糖(ALGO)和磷酸寡糖(PO)為改良劑，結(jié)合成β-LG-GLCN、β-LG-CPO、β-LGCHS、β-LG-ALGO和β-LG-PO。通過ELISA免疫試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其抗原性和免疫原性都降低[6]。

1.2.3 酶水解改性

蛋白酶催化乳蛋白具有表位的片段水解，可顯著降低其抗原性，防止牛乳過敏。Kananen等用硫化氫對(duì)乳清蛋白處理使蛋白構(gòu)象改變，然后用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理，β-LG抗原性顯著降低，并且在胰蛋白酶水解30 min后β-LG的抗原性接近0[7]。

Wroblewsak選用了堿性蛋白酶(Alcalase)和木瓜蛋白酶(Papain)單獨(dú)或組合，分別于水解開始時(shí)和水解100 min后加入水解乳清蛋白，3種方式水解時(shí)間均為120 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Alcalase和Papain二步水解降低乳清蛋白過敏性的效果最佳[8]。酶的選擇是乳清蛋白酶法改性的關(guān)鍵，由于乳蛋白過敏原表位的廣泛存在，從眾多的蛋白酶中篩選合理的酶具有一定的盲目性。對(duì)酶的種類、酶解模式、酶解程度等因素的選擇及其酶解過程中各產(chǎn)物對(duì)其致敏性與風(fēng)味的影響機(jī)理，還需要進(jìn)一步的研究。

1.2.4 乳酸發(fā)酵改性

乳酸發(fā)酵改性的機(jī)制可能是乳酸菌產(chǎn)生I型及Ⅱ型干酪素，通過免疫調(diào)節(jié)機(jī)制防止過敏；另一種可能的機(jī)制是乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生水解乳蛋白的酶，進(jìn)而水解乳蛋白。據(jù)報(bào)道，采用滅菌處理的牛乳經(jīng)蛋白酶水解改性或糖基化改性后，再用乳酸菌發(fā)酵處理，改性效果更佳。

1.2.5 脂肪酸改性

Akita等研究了脂肪酸結(jié)合β-LG的免疫原性，采用硬脂酸-β-LG的5種不同程度的結(jié)合物作為抗原：天然β-LG，0-β-LG，0.3-β-LG，4.0-β-LG以及13.1-β-LG(脂肪酸濃度為0.0，0.0，0.3，4.0，13.1 mol/L賴氨酸)。通過ELISA免疫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低脂肪酸化β-LG的免疫原性降低，而高脂肪酸化的β-LG的免疫原性并無降低，反而升高。與天然β-LG和13.1含量的β-LG相比，0.3-β-LG具有更高的結(jié)合抗體的能力。這可能是由于改性β-LG比天然β-LG具有更多的非折疊結(jié)構(gòu).從而導(dǎo)致更多的抗原位點(diǎn)暴露[9]。

2 生產(chǎn)加工對(duì)乳蛋白過敏性的影響

消除或降低牛乳蛋白質(zhì)的過敏性生產(chǎn)出低過敏或無過敏的乳制品是乳品工業(yè)面臨的挑戰(zhàn)之一。乳品加工中的物理化學(xué)和生物的方法都會(huì)對(duì)乳制品的過敏原性產(chǎn)生影響。

2.1 加熱工藝對(duì)乳蛋白過敏性的影響

在加熱過程中，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重要的變化。這種變化的本質(zhì)和程度依賴于溫度和熱處理的時(shí)間、蛋白的內(nèi)部特征以及環(huán)境的物理化學(xué)條件(如pH值)。通常55～70℃時(shí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開.三級(jí)結(jié)構(gòu)破壞；70～80℃時(shí)S-S鍵斷裂，分子內(nèi)和分子間發(fā)生新的相互作用；80～90℃時(shí)二硫鍵重排；90～100℃時(shí)蛋白質(zhì)之間通過S-S鍵聯(lián)接形成聚合物[2]。

β-LG在酸性pH值下抗變性，在堿性pH值下易變性。β-LG的熱變性范圍為50～90℃，其不可逆變性發(fā)生在pH值為7.0(70℃)。α-LA在64℃時(shí)空間構(gòu)象發(fā)生改變.因其缺乏游離的半胱氨酸殘基。故無法引起和傳播變性反應(yīng)。但是，當(dāng)具有游離巰基的蛋白(β-LG、BSA)存在時(shí)，α-LA也可能發(fā)生部分的聚合。

酪蛋白對(duì)熱非常穩(wěn)定，能經(jīng)受130℃(1 h)，或者150℃(幾秒鐘)，而不凝結(jié)。相反，球狀的乳清蛋白是熱敏性的，其熱穩(wěn)定性因組分不同而不同，順序是：LGS＜BSA＜β-LG＜α-LA。在120℃加熱15 min并不影響牛乳酪蛋白的抗原性.在70～80℃和100℃加熱BSA和LGS失去了抗原性[6]。

2.2 酶解對(duì)乳蛋白過敏性的影響

相對(duì)于構(gòu)象型表位而言食品加工對(duì)線性表位影響較小，但酶解對(duì)線性表位影響較大。深度酶解的嬰幼兒配方乳粉已經(jīng)上市，它降低了乳品的過敏原性，但對(duì)極少數(shù)人群仍然存在致敏的危險(xiǎn)性。

Linda利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解-乳球蛋白發(fā)現(xiàn)水解后的乳球蛋白的過敏性降低但不會(huì)完全消除[10]。Bernard用胰蛋白酶水解酪蛋白發(fā)現(xiàn)其可以水解肽鏈第152位、53～139位片段；用纖溶酶可以水解酪蛋白的第106～209位片段，這些多肽片段中包含有過敏性表位，經(jīng)水解后可以使酪蛋白的過敏性降低[11]。

2.3 發(fā)酵對(duì)乳蛋白過敏性的影響

牛乳經(jīng)過發(fā)酵后其過敏原性會(huì)大大降低甚至消失。其原因在于酶解及乳酸引起蛋白質(zhì)降解，另外發(fā)酵后的酸奶能夠調(diào)整腸道菌群，調(diào)節(jié)黏膜免疫，對(duì)抗食物過敏有很好的作用[12]。

Haddad發(fā)現(xiàn)酸奶生產(chǎn)中加熱溫度為90～95℃，時(shí)間10～15 min這時(shí)β-LG與酪蛋白微粒結(jié)合然后采用嗜溫和嗜熱乳酸菌或混合菌種37℃發(fā)酵。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳清蛋白的抗原性比鮮乳降低了99%以上[13]。

3 低致敏乳制品的生產(chǎn)

鑒于嬰幼兒較高的牛乳蛋白過敏癥狀發(fā)生率和少年兒童由于日益增長的牛乳攝入而引發(fā)的牛乳過敏問題，開發(fā)低致敏的乳制品已經(jīng)成為各大乳品企業(yè)在新品開發(fā)過程中必須考慮的問題。

3.1 低致敏乳品原料的制備

生產(chǎn)低致敏性的乳制品，首先可以優(yōu)先選擇經(jīng)過特殊處理的乳品原料，以降低乳品過敏的風(fēng)險(xiǎn)。M.Eugenia等報(bào)道了一種生產(chǎn)清除β-LG以獲得低致敏性的濃縮乳清蛋白的方法，采用超濾、調(diào)整pH以及沉淀、水洗等多重復(fù)合工藝，可以得到基本不含β-LG的乳品原料，用作為兒童配方奶粉或者其他乳制品的優(yōu)選原料[14]。

酶法水解乳清蛋白或者酪蛋白來制備低致敏乳品原料應(yīng)用最為廣泛，然而這種方法會(huì)導(dǎo)致乳品原料功能性變差，因此有人在酶法水解的基礎(chǔ)上，研究了酶法結(jié)合高壓處理來制備低致敏乳品原料。Chicon等研究了高壓條件下酶解酪蛋白的工藝及產(chǎn)品特性，采用100～300 MPa、15 min、溫度37℃的工藝，結(jié)果表明高壓下，乳蛋白對(duì)胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等更加敏感，產(chǎn)品不僅致敏性降低，同時(shí)也能保持更好的乳化性和熱穩(wěn)定性[15]。

Javier F等結(jié)合微波輻照工藝對(duì)乳蛋白的酶解進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2450 Hz、560 W、5 min的微波處理?xiàng)l件結(jié)合酶解工藝，可以獲得更高水解度和更低致敏性的乳品原料[16]。相信隨著研究的深入，各種物理、化學(xué)或者生物的方法將更廣泛的被應(yīng)用到低致敏乳制品原料的生產(chǎn)加工中，為低致敏乳制品的研制提供更加豐富的備選原料。

3.2 脫敏配方乳制品的研制

利用水解蛋白是獲得低敏配方的最好方法，即對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾從而大大減少具有抗原活性物質(zhì)的量。目前，根據(jù)水解的程度，水解蛋白配方分為兩種，一種是適度水解蛋白配方(Partially Hydrolyzed Formula，PHF)，又稱為部分水解配方；另外一種是完全水解蛋白配方(Extensively Hydrolyzed Formula，EHF)，又稱為深度水解配方[17]。

完全水解配方是將牛乳蛋白通過加熱、超濾、水解等特殊工藝降低蛋白質(zhì)成份的抗原性，使其終產(chǎn)物大多為二肽、三肽和少量的游離氨基酸。過敏原獨(dú)特型表位的空間構(gòu)象和序列大大減少，顯著降低了抗原性。完全水解配方已顯示能有效地降低牛乳蛋白過敏的發(fā)生，并被推薦用于牛乳蛋白過敏嬰兒的治療。研究證明完全水解配方與氨基酸配方對(duì)特應(yīng)性皮炎的治療效果相似，完全水解蛋白配方與氨基酸配方都能支持嬰兒正常的生長發(fā)育。

適度水解配方是對(duì)牛奶蛋白進(jìn)行適度的水解，利用蛋白酶切斷肽鏈，使之成為小肽段，改變牛奶蛋白的表位(抗原決定基)，從而降低蛋白的抗原性，但還保留微量抗原活性。由于保留了部分抗原性，嬰兒持續(xù)少量牛奶蛋白抗原的攝入可以誘導(dǎo)免疫耐受。因此，適度水解配方通常推薦用于特應(yīng)性高風(fēng)險(xiǎn)嬰兒的初級(jí)干預(yù)，以及牛奶過敏的嬰兒經(jīng)過一段時(shí)間的完全水解配方治療后，癥狀緩解后的續(xù)貫治療，以期誘導(dǎo)耐受。

完全水解蛋白和適度水解配方在過敏的初級(jí)預(yù)防方面的效果孰優(yōu)孰劣，目前尚無定論。適度水解蛋白配方曾被多項(xiàng)臨床研究證實(shí)具有過敏預(yù)防效果，被推薦作為嬰幼兒過敏預(yù)防的早期膳食干預(yù)。Halken等發(fā)現(xiàn)完全水解配方喂養(yǎng)有非常好的臨床效果，但適度水解配方喂養(yǎng)在介導(dǎo)對(duì)牛奶蛋白質(zhì)和其他食物蛋白質(zhì)的耐受性方面也有良好的效果，并且還可促進(jìn)對(duì)吸人性抗原耐受性。有大量研究顯示，適度水解配方可降低嬰兒特應(yīng)性皮炎的發(fā)生，并且這種預(yù)防效果可持續(xù)到3歲以后[18]。

3.3 低致敏發(fā)酵乳制品的研制

近年來的研究表明，食用發(fā)酵食品，尤其是以牛乳為基料的乳制品可減輕一些遺傳性過敏的癥狀并限制病癥的發(fā)展。因此將益生菌應(yīng)用于乳制品中，開發(fā)新的功能水解物是減緩乳品過敏的有效技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中β-LG，α-LA，αs-酪蛋白；β-酪蛋白和BSA的抗原降解率分別為20.54%，31.8%，4.08%，18.67%和25.47%。郭鸰等進(jìn)行了發(fā)酵生產(chǎn)低致敏乳源蛋白基料的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)采用一株瑞士乳桿菌為發(fā)酵劑，在10%的脫脂乳中添加5%的乳清蛋白為發(fā)酵原料制備低致敏乳源蛋白是可行的[19]。

目前在國內(nèi)市場(chǎng)上銷售的兒童牛奶，配方仍然選擇鮮乳或者乳粉，還沒有一款以發(fā)酵乳為基料的產(chǎn)品問世。牛乳中含有大量的酪蛋白，在乳酸菌發(fā)酵過程中，酪蛋白的抗原降解率較低，近期，在日本有企業(yè)開發(fā)出了適合6個(gè)月大嬰兒食用的發(fā)酵乳制品，這種產(chǎn)品酸度較低，且特別添加果蔬汁，強(qiáng)化營養(yǎng)。Nicole等研究發(fā)現(xiàn)，采用Streptococcus thermophilus subsp.和Salivarius strain復(fù)合菌種發(fā)酵脫脂牛奶，可使β-LG減少約90%；發(fā)酵甜乳清，可使β-LG減少約70%[20]。因此國內(nèi)企業(yè)及相關(guān)研究機(jī)構(gòu)可通過菌種優(yōu)化篩選的方法來生產(chǎn)酪蛋白有較高脫敏率的發(fā)酵型產(chǎn)品，或者通過采用乳清蛋白為原料進(jìn)行低致敏性發(fā)酵乳制品的開發(fā)，以提高乳制品的附加值。

3 結(jié)束語

牛乳蛋白營養(yǎng)豐富，是不可多得的良好膳食補(bǔ)充。雖然牛奶蛋白可能引起人體，特別是嬰幼兒的過敏癥狀，但牛乳蛋白經(jīng)在嬰幼兒配方奶粉中的脫敏研究已經(jīng)有了長足的發(fā)展，并有著較為成熟和安全的產(chǎn)品配方，以保障嬰幼兒的營養(yǎng)攝入和飲食安全。牛乳蛋白過敏在少年兒童和成年人中也有一定的發(fā)生率，因此同樣需要引起重視，開發(fā)低致敏性的兒童配方乳制品等乳品。相信通過乳品科技工作者對(duì)牛乳蛋白過敏源的科學(xué)認(rèn)識(shí)，并通過加工、改性等一系列手段進(jìn)行脫敏處理，設(shè)計(jì)合理的低致敏性乳制品配方，定會(huì)為消費(fèi)者奉上健康安全的乳制品。

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Milk allergy and the study of hypoallergenic dairy produt

HU Chang-li,CHEN Li-jun,SONG Xiao-hong,LU Yang
（Beijing Sanyuan Food Co.ltd.,Technigue Center,Beijing 100085,China）

Milk allergy is a kind of common food allergy,Milk protein allergy,milk protein modification were expounded in this paper.The effect of processing on milk protein allergy is analyzed and the current development of hypoallergenic dairy products is also reviewed.

milk；protein allergy；modification

TS252.1

B

1001-2230（2011）03-0042-04

2010-07-22

胡長利（1980-），男，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)與技術(shù)。

陳歷俊