煙草基因組學(xué)研究方法篇：5.煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和應(yīng)用

王紹美

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

蛋白質(zhì)組（proteome）最初指細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式，后引申指一個(gè)基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組研究是生命科學(xué)研究進(jìn)入后基因組時(shí)代的里程碑，也是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一和功能基因組學(xué)研究的新興學(xué)科、熱點(diǎn)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法主要是基于蛋白質(zhì)樣品的分離、蛋白質(zhì)的鑒定及蛋白質(zhì)間的相互作用等技術(shù)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

1.1 蛋白質(zhì)的分離技術(shù)

用于蛋白質(zhì)分離的技術(shù)有雙向電泳（two-dimensional electrophoreisis,2-DE）、熒光差異雙向凝膠電泳（two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）、高效液相色譜（RP-HPLC）、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis,CE）、多維液相色譜（MDLC）等技術(shù)。其中最主要的技術(shù)是雙向電泳和高效液相色譜。2-DE基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和分子量大小不同，先后在兩個(gè)方向上分離蛋白質(zhì)復(fù)雜組分[1]。這種技術(shù)具有分辨率和靈敏度較高，可用于計(jì)算機(jī)定量分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)，用高靈敏度微量化學(xué)方法較易對(duì)2-DE膠上的分離蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和表征的特點(diǎn)，因此，目前仍是蛋白質(zhì)分離的核心技術(shù)，適宜于進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。該技術(shù)的缺點(diǎn)是疏水性蛋白（如膜蛋白）難溶于樣品緩沖液；高分子量蛋白、極酸和極堿性蛋白易在電泳中丟失；低豐度（拷貝數(shù)小于1000）蛋白無(wú)法檢測(cè)等。RP-HPLC作為蛋白質(zhì)分離和純化的最常用方法，一般是將液相色譜分離技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，首先酶解混合蛋白，再經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)纳V分離，并通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段、鑒定蛋白。這項(xiàng)技術(shù)將色譜與質(zhì)譜結(jié)合實(shí)現(xiàn)了高通量篩選和進(jìn)行蛋白質(zhì)混合物鑒定，操作過(guò)程簡(jiǎn)單、分析速度快、分離能力好、靈敏度高，能富集低豐度蛋白，可迅速、完全自動(dòng)化鑒定極微量蛋白質(zhì)，但不適用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.2 蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)

用于蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)主要有傳統(tǒng)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物質(zhì)譜鑒定（mass spectrometry,MS）技術(shù)和同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽法（isotope-coded affinity tags,ICAT）。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)指Edman降解法測(cè)N端序列和氨基酸組成分析法，前者有測(cè)定速度較慢，費(fèi)用偏高，靈敏度低等缺點(diǎn)；后者因耗資低而常用于蛋白質(zhì)的鑒定。MS技術(shù)因其具有高通量、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、易于自動(dòng)化、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于分析凝膠上的微量蛋白，成為蛋白質(zhì)鑒定的主要支撐技術(shù)。該技術(shù)基本原理是先使蛋白質(zhì)樣品分子離子化，然后根據(jù)不同離子之間的質(zhì)荷比（m/z）差異來(lái)分離并確定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，再根據(jù)蛋白質(zhì)酶解后所得到的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）、肽序列標(biāo)簽（PST）和肽階梯序列（PLS）去檢索蛋白質(zhì)或核酸序列庫(kù)[2]。生物質(zhì)譜分析系統(tǒng)根據(jù)離子源不同分為基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）。ICAT是采用同位素標(biāo)記多肽或蛋白質(zhì)的親和標(biāo)簽技術(shù)，具有靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，能用于快速定性和定量鑒定疏水性和低豐度蛋白質(zhì)，并可直接測(cè)試混合樣品，進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)研究。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)有酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2Z）系統(tǒng)、噬菌體展示（phage display）技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片（protein chip）技術(shù)、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法等。酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)原理是在真核模式生物酵母中，當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，誘導(dǎo)已知基因的啟動(dòng)子，從而啟動(dòng)報(bào)告基因在酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)該基因表達(dá)產(chǎn)物而判別誘餌蛋白和靶蛋白之間是否存在相互作用。該技術(shù)具有易于自動(dòng)化高通量等特點(diǎn)，已成為研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜的重要手段，但分析過(guò)程中存在假陽(yáng)性和假陰性的現(xiàn)象。噬菌體展示技術(shù)是在編碼噬菌體外殼蛋白的pⅢ或pVⅢ基因上連接一個(gè)單克隆抗體基因序列的技術(shù)。噬菌體生長(zhǎng)時(shí)表面表達(dá)出的相應(yīng)單抗在過(guò)柱時(shí)，目的蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合相應(yīng)抗體。該技術(shù)具有高通量及簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，它可以檢測(cè)出酵母雙雜交技術(shù)檢測(cè)不出的本身具有激活轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、微型化和自動(dòng)化的蛋白質(zhì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測(cè)蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法在煙草中的應(yīng)用

2.1 應(yīng)用于基礎(chǔ)研究

煙草作為模式生物應(yīng)可用于蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。煙草的Bright-Yellow-2（BY2）細(xì)胞系是從煙草幼苗愈傷組織中獲得的，該細(xì)胞系具有快速生長(zhǎng)、易于遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分裂同步等優(yōu)點(diǎn)，是目前植物基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞系之一。Duby等[3]以BY2細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)材料，構(gòu)建了可供蛋白質(zhì)快速網(wǎng)上鑒定和蛋白質(zhì)圖譜比對(duì)的BY2細(xì)胞系蛋白質(zhì)組參考圖譜。2008年，Gerber等[4]在煙草BY2細(xì)胞系中研究了細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞靶點(diǎn)信號(hào)蛋白質(zhì)組圖譜。Goulet等[5]用Nicotiana benthamiana葉片研究質(zhì)外體蛋白質(zhì)組的結(jié)果，將成為植物與病菌互作或細(xì)胞壁代謝以及細(xì)胞壁分泌蛋白研究的有用工具。

2.2 應(yīng)用于逆境脅迫研究

煙草在生長(zhǎng)過(guò)程中遭受的各種生物脅迫和非生物脅迫會(huì)造成煙葉產(chǎn)量、質(zhì)量下降，這些逆境脅迫會(huì)通過(guò)逆境感知信號(hào)來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)的合成表達(dá)，以調(diào)整自身生理狀態(tài)和外部形態(tài)適應(yīng)外界環(huán)境變化。為了解釋煙草抗逆機(jī)制、提高煙草抗逆性，Pineda等[6]、Razavizadeh等[7]、Dani等[8]、王紹美[9]、蓋英萍[10]、梁景霞[11]分別對(duì)生物脅迫和非生物脅迫下煙草蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。

2.3 應(yīng)用于代謝調(diào)控途徑研究

煙草的代謝調(diào)控直接影響煙葉的化學(xué)成分協(xié)調(diào)，從而影響煙葉內(nèi)在品質(zhì)。2010年，Kaida等[12]研究了紫色酸性磷酸酶在煙草細(xì)胞壁蛋白質(zhì)去磷酸化中的潛在作用；Chivasa等[13]對(duì)信號(hào)調(diào)節(jié)物 eATP的影響展開(kāi)了代謝調(diào)控蛋白質(zhì)組研究。2009年，Millar等[14]開(kāi)展了煙草細(xì)胞系形成次生壁的細(xì)胞壁和分泌蛋白質(zhì)組研究。王茂等[15]進(jìn)行了信號(hào)誘導(dǎo)物結(jié)合栽培措施的代謝調(diào)控研究。

2.4 不同生態(tài)類型煙葉香氣風(fēng)格形成機(jī)理研究

我國(guó)生產(chǎn)的煙葉因生態(tài)條件的影響而具有不同的香氣風(fēng)格，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以探討煙草應(yīng)答不同生態(tài)條件的分子機(jī)理和不同生態(tài)類型形成不同香氣風(fēng)格的機(jī)理[16]。

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