補氣類中藥抗神經(jīng)細胞缺血/缺氧性凋亡作用的研究進展

姚于飛， 高幼奇， 胡國柱

(1.南昌大學醫(yī)學院，江西南昌， 330006;2.江西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 南昌 330006)

腦中風引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷都具有神經(jīng)細胞缺血/缺氧的病理發(fā)展過程，其神經(jīng)細胞死亡許多屬于細胞凋亡。故細胞凋亡調(diào)節(jié)的干預具有極大的治療潛力，其將可能成為腦中風以及血管性老年癡呆的預防和治療的新途徑。因此本文就細胞凋亡與腦缺血/缺氧的關系及機制，以及補氣類中藥對凋亡影響的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 細胞凋亡的生物學特征

凋亡細胞不但存在形態(tài)改變［1］，而且具有細胞生化及基因表達變化。細胞凋亡主要有三條途徑:①外源性途徑:Fas/FasL、TNFRI/TNF－α、DR3/Apo3L、DR4/Apo2L 及 DR5/Apo2L等配體與受體結(jié)合后激活caspases家族蛋白并引發(fā)級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡［2－5］。②內(nèi)源性途徑:生長因子、激素、細胞因子缺乏，以及自由基、缺氧、照射、病毒感染等非受體介導的凋亡刺激，其引起B(yǎng)H3－only蛋白家族(BAD、BIK、BID、HRK、BIM、BMF、NOXA、PUMA)活化，導致線粒體外膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放、膜電位下降，促使cyt c、DIABLO、絲氨酸蛋白酶 Omi、凋亡誘導因子(apoptosis－inducing factor，AIF)、內(nèi)切酶G、caspase活化的 DNA酶(caspase activated DNAse，CAD)等釋放，最終誘導細胞凋亡［6－7］。③穿孔素－顆粒酶 B途徑:顆粒酶B進入細胞后直接裂解天門冬氨酸殘基活化caspases 蛋白［8－10］。

2 補氣類中藥對缺血/缺氧后神經(jīng)細胞凋亡的影響

早在1993年Linnik M.D等人［11］結(jié)扎大鼠右頸總動脈并栓塞右大腦中動脈造成大腦局部缺血24 h后，從缺血區(qū)域大腦皮層細胞提取的DNA經(jīng)凝膠電泳后顯示出凋亡特征性梯狀條帶。急性缺氧和慢性間斷缺氧大鼠模型證明缺氧可誘導遲發(fā)性神經(jīng)細胞凋亡［12－13］。大鼠大腦皮層神經(jīng)元經(jīng)缺氧復氧培養(yǎng)也證明缺血/缺氧能誘發(fā)神經(jīng)細胞凋亡［14－17］。腦缺血和出血均有缺血/缺氧的病理過程，而腦中風的療效中西醫(yī)結(jié)合均較單純西醫(yī)好，中醫(yī)藥對腦中風的治療補氣中藥不可缺少。

2.1 抗氧自由基損傷

腦缺血/缺氧條件下中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生大量的自由基，導致神經(jīng)細胞凋亡［18］。D－半乳糖造模的衰老小鼠給予大棗水煎劑灌胃6周后腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著提高，丙二醛(MDA)顯著下降［19］。腹腔注射山藥多糖40 d后腦B型單胺氧化酶(MAO－B)活性顯著下降，GSH－PX活性、SOD 活性、腦 Na+/K+－ATP 酶活性顯著提高［20］。人參總皂苷、白術多糖、黃精多糖、甘草酸二銨(DG)或甘草總黃酮治療大腦中動脈栓塞(MCAO)模型大鼠，其腦組織中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、MDA含量降低，SOD活性升高，腦組織病理損傷減輕，細胞凋亡減少［21－26］。

2.2 抑制細胞內(nèi)Ca2+的超載

連二亞硫酸鈉無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)胚鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞模擬缺氧/缺糖證明，黨參皂苷L1顯著降低神經(jīng)細胞的凋亡率，細胞內(nèi)Ca2+平均熒光值與模型組(47.37±9.68)比較，0.1～0.01 mg/L黨參皂苷L1(27.34±8.57～36.55±14.23)能顯著降低細胞內(nèi)Ca2+［27］。采用激光共聚焦掃描檢測缺氧培養(yǎng)的胚大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)游離鈣發(fā)現(xiàn)，缺氧組熒光增強度為(73.5±10.31)%，缺氧 +無鈣組為(4.5±2.58)%，缺氧+不同濃度人參皂甙Rb1(GSRb1)組(20、40、60、80 μmol/L)分別為(20.2 ±3.41)%、(13.6 ±2.98)%、(10.5±3.62)%和(12.7±4.51)%(均P＜0.01)，證明缺血缺氧時神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣的上升主要是來自細胞外鈣離子內(nèi)流，GSRb1可通過抑制細胞外鈣離子內(nèi)流減輕細胞內(nèi)的鈣超載，保護缺血神經(jīng)元［28］。人參二醇皂苷(PDS)(1.5 g/L)抑制缺氧大鼠大腦皮層神經(jīng)元缺氧1 h時的L－型鈣通道活性，L－型鈣通道的開放時間由缺氧前(9.1±1.0)ms降低至缺氧后(2.1±0.4)ms(P＜0.01)，開放概率由缺氧前的(0.165±0.025)減少至缺氧后的(0.021±0.009)(P＜0.01)，證明PDS可抑制缺氧誘導的鈣通道的開放并減少鈣離子的內(nèi)流［29］。黃芪多糖以1.0 g/kg于MCAO模型制作前30 min和制作后8 h分兩次腹腔注射，大鼠缺血1 h再灌注24 h后腦組織中Ca2+、谷氨酸、天門冬氨酸等含量顯著低于單純模型組(P＜0.05～P＜0.01)［30］。三七總皂苷降低缺氧/缺糖培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子濃度，抑制神經(jīng)細胞凋亡［31］。

2.3 對凋亡相關基因表達的調(diào)控

人參皂苷Rg125～100 mg/kg灌胃7 d后制備MCAO模型缺血2 h再灌注22 h發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1(50～100 mg/kg)顯著地減少缺血側(cè)腦組織 Caspase－3 和增加 Bcl－2表達［32］。而腹腔注射10～40 mg/kg給MCAO模型大鼠，2 h～24 h后腦組織 Bcl－2 增高，Bax 降低，Bcl－2/Bax 比值顯著上調(diào);缺血大鼠海馬CA1區(qū)Fas陽性細胞數(shù)(15.20±3.16～9.20±3.49)顯著低于單純模型組(26.00±5.64)，F(xiàn)as－L表達陽性細胞數(shù)(13.40±3.03～8.20±3.01)也低于單純模型組(21.20±4.71)，Caspase－3 表達陽性細胞(12.30 ±2.91、7.30±3.56)均低于單純模型組(17.40±3.20)，腦組織cjun N－末端激酶(pJNK)的陽性表達率(23.89±6.77)～(9.15 ±4.77)低于單純模型組(27.15 ± 8.46)［33－35］。即使在MCAO模型大鼠缺血再灌注后腹腔注射人參皂苷Rb1(40 mg/kg)，也可見再灌注12 h～10 d內(nèi)神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NAIP)陽性細胞數(shù)顯著高于缺血組，Bcl－2陽性細胞數(shù)上升，Bax陽性細胞下降［36］。大鼠全腦缺血模型制備前3 d給人參皂苷Rb130 mg/kg并持續(xù)至缺血后3d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單純?nèi)毖M比較CA1、DG及皮層神經(jīng)元內(nèi)的bcl－2表達顯著增加，而bax表達顯著減少［37］。體外新生大鼠大腦皮層神經(jīng)細胞缺氧培養(yǎng)也證明人參皂苷Rb1在50～100 mg/L的濃度范圍內(nèi)通過增加缺氧神經(jīng)細胞Bcl－2，減少Bax的表達，提高Bcl－2/Bax比值達到抑制神經(jīng)細胞缺氧性凋亡的作用［15］。

大鼠口服西洋參莖葉皂苷7 d后制作成MCAO模型，結(jié)果西洋參莖葉皂苷(50、100 mg/kg)各組TUNEL陽性細胞顯著少于缺血模型組，caspase－3 mRNA表達及 caspase－3陽性細胞數(shù)均顯著低于缺血模型組［38］。

腹腔注射黃芪注射液4.5 g/kg 30 min后制作MCAO模型缺血2 h再灌注6 h后發(fā)現(xiàn)，與模型組相比腦組織Bax陽性細胞減少，而 Bc1－2陽性細胞增加(P＜0.05)［39］。大鼠MCAO模型制作前12 h和30 min腹腔給予黃芪注射液，腦缺血3 h后每12 h注射一次，結(jié)果再灌注12 h、24 h、48 h后各時間點caspase－8陽性細胞顯著低于模型組［40］。黃芪煎劑(6 g/kg/d)灌胃1次，共7 d，然后制作大鼠MCAO模型，腦缺血2 h再灌注6 h后腦組織Fas－L陽性細胞較模型組顯著降低［41］。大鼠MCAO模型缺血2 h再灌注24 h前1 h腹腔注射黃芪注射液200 mg/kg，再灌注24 h后黃芪組大鼠缺血側(cè)皮層c－fos陽性細胞顯著少于模型組［42］。缺氧缺糖0.5 h復氧復糖培養(yǎng)原代大鼠海馬神經(jīng)細胞0～120 h，黃芪注射液(0.5 g/L生藥)于缺氧缺糖時加入，其各個時間點c－Jun氨基末端激酶3(JNK3)在mRNA、蛋白水平，以及JNK3活性水平上均顯著低于單純?nèi)毖跞碧墙M，并抑制了神經(jīng)元凋亡［43］。黃芪注射液(黃芪10、50、100 g/L 組)能顯著降低缺氧培養(yǎng)誘導的神經(jīng)細胞凋亡率，增加了缺氧的神經(jīng)細胞Bcl－2 的表達，減少了 Bax 的表達，提高了 Bcl－2/Bax 比值［14，44］。

MCAO制作前10 min舌下靜脈給予甘草酸二銨(DG)注射液20 mg/kg，缺血2 h再灌注24 h后梗死側(cè)腦組織中，DG組Bcl－2表達顯著高于缺血組［23］。DG對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后NF－κB p65和Caspase－3的表達明顯低于對照組，TUNEL 及檢測也證明抑制了神經(jīng)元凋亡［45，46］。

3 展望

盡管缺血后不同基因的變化對細胞凋亡的調(diào)控及影響的確切機制尚不清楚，但理解細胞凋亡在缺血性神經(jīng)細胞死亡中的作用具有重要的臨床意義?？辜毎蛲鰧⒖赡艹蔀槟X中風神經(jīng)細胞損傷的治療有效手段。根據(jù)中醫(yī)理論，同一藥性中藥功效相同或相近。事實上人參、黃芪、黨參［27］、黃精、甘草、西洋參、太子參［47－48］、白術［49］、大棗［50］、山藥［51］等補氣類中藥都具有抗多種原因引起的細胞凋亡作用。根據(jù)現(xiàn)有補氣類中藥抗神經(jīng)細胞凋亡研究結(jié)果，我們有理由推測所有補氣中藥均有抗神經(jīng)細胞缺血缺氧性凋亡的作用。

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