調(diào)節(jié)性容積減小過程中Ca2 + 和pH 對鉀通道的調(diào)控*

楊林杰， 王立偉， 陳麗新△

( 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院1 藥理學(xué)教研室，2 生理學(xué)教研室，廣東 廣州510632)

動(dòng)物細(xì)胞在低滲環(huán)境中容積脹大時(shí)可以發(fā)生保護(hù)性的調(diào)節(jié)性容積減小( regulatory volume decrease，RVD) ，K+通道的開放所介導(dǎo)的K+外流是這一過程的重要機(jī)制［1］。然而，由于研究技術(shù)和方法的限制，對于離子通道活動(dòng)的研究往往會(huì)破壞細(xì)胞的完整性和調(diào)節(jié)能力，因此RVD 過程中整體細(xì)胞水平的K+通道活動(dòng)調(diào)節(jié)仍需進(jìn)一步探討。而在已經(jīng)充分掌握單個(gè)K+通道特性的基礎(chǔ)上，可以將不同的調(diào)節(jié)因素加以整合，構(gòu)建RVD 過程中整體細(xì)胞水平K+通道活動(dòng)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。許多動(dòng)物細(xì)胞的RVD 過程中存在胞漿Ca2+濃度和pH 值的改變，本文就這一變化的發(fā)生機(jī)制及其對RVD 過程中K+通道活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用作一綜述。

1 參與RVD 過程的K+通道類型

參與RVD 過程的K+通道類型與細(xì)胞類型有關(guān)。早期，在對腹水瘤Ehrlich 細(xì)胞的一系列研究表明，RVD 過程中介導(dǎo)容積敏感性K+電流( volume－activated K+current，IK，vol) 的是一種雙孔酸敏感性K+通 道( tandem－poredomain acid－sensitive K+channels，TASK) ，該通道的活動(dòng)對pH 敏感，而不受胞漿的Ca2+濃度影響［2］。隨后，大量研究表明Ca2+依賴性K+通道參與多種細(xì)胞的RVD 過程，這些通道的活動(dòng)受胞漿Ca2+濃度調(diào)節(jié)。在表皮樣癌KB－3－1 細(xì)胞中，低滲刺激可以激活中度電導(dǎo)Ca2+依賴性K+通道( intermediate－conductance Ca2+－activated K+channel，IK1) ，后者在RVD 過程中起關(guān)鍵作用［3］。在人眼篩板細(xì)胞中，低滲刺激可以導(dǎo)致大電導(dǎo)Ca2+依賴性K+通道( large－conductance Ca2+－activated K+channel，BK) 激活［4］。最近，部分研究表明同一種細(xì)胞的RVD 過程可以同時(shí)有Ca2+依賴性和電壓依賴性K+通道發(fā)揮作用。電壓依賴性K+通道( voltage activated K+channel，Kv) 亞型Kv1.3是參與T 淋巴細(xì)胞RVD 過程的主要K+通道類型，同時(shí)，IK1 也參與這一過程［5］。Harron 等［6］證實(shí)，電壓依賴性K+通道Kv4.1、Kv4.3 和Ca2+依賴性K+通道BK、IK1 在人類呼吸道上皮Calu－3 細(xì)胞RVD過程中均發(fā)揮作用。本課題組最近的研究提示Ca2+依賴性和電壓依賴性K+通道在人低分化鼻咽癌CNE－2Z 細(xì)胞RVD 過程中均發(fā)揮作用，其中IK1 的作用更為重要［7］。

因此，在不同類型甚至同一類型細(xì)胞中可以有不同類型的K+通道參與RVD 過程，其中Ca2+依賴性K+通道的活動(dòng)受胞漿Ca2+濃度調(diào)節(jié)，而另一部分類型K+通道則對pH 值、電壓等因素敏感。RVD 過程中Cl－大量外流可以引起細(xì)胞膜去極化，為電壓依賴性K+通道的激活提供條件。下面，我們主要針對RVD 過程中胞漿Ca2+濃度和pH 值的變化、機(jī)制及其對K+通道活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用展開論述。

2 RVD 過程中的胞漿Ca2+濃度改變及影響

2.1 RVD 過程中胞漿Ca2+濃度改變 在腎小管上皮細(xì)胞、腦膠質(zhì)細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞等多種哺乳動(dòng)物中，低滲刺激引起的細(xì)胞容積脹大和RVD 過程中均伴隨有胞漿Ca2+濃度的升高，并且這一特征性改變在RVD 過程中發(fā)揮重要作用［8－11］。盡管在急性分離的小鼠膽管細(xì)胞中觀察到該細(xì)胞RVD 過程不完全依賴于細(xì)胞內(nèi)、外Ca2+，但Ca2+在其RVD 過程中同樣發(fā)揮作用［12］。

2.2 TRP 通道家族在胞漿Ca2+濃度升高中的作用

瞬時(shí)受體電位( transient receptor potential，TRP) 通道家族廣泛表達(dá)于多種動(dòng)物細(xì)胞，是一類機(jī)械敏感的非選擇性陽離子通道，在RVD 過程中胞漿Ca2+濃度升高中發(fā)揮一定作用。目前，對于TRP 通道家族香草素受體類亞型4( transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4) 在RVD 過程中的作用研究較多，普遍認(rèn)為該通道起到滲透壓感受器的作用，低滲刺激及隨后的RVD 過程中TRPV4 通道可介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流，從而使胞漿Ca2+濃度升高［13－15］。Pan 等［13］在人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TRPV4 通道激動(dòng)劑和低滲刺激均可迅速導(dǎo)致胞漿Ca2+濃度升高3 倍，而利用TRPV4 通道阻斷劑、去除細(xì)胞外液中的Ca2+以及RNA 干擾( RNA interference，RNAi) 技術(shù)抑制TRPV4 基因表達(dá)均可以抑制低滲刺激引起的胞漿Ca2+濃度升高及RVD。最近的研究證實(shí)，TRPV4 通道蛋白N－末端的酪氨酸殘基在低滲刺激引起該通道激活的過程中起關(guān)鍵作用，Src 家族酪氨酸激酶( Src family tyrosine kinases，SFKs) 介導(dǎo)的N－末端酪氨酸磷酸化使通道對滲透壓敏感性增加［16］。此外，TRP 通道家族的其它通道類型也參與這一過程。在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，對牽張刺激敏感的TRPV1、TRPV2 以及TRP 通道家族經(jīng)典類亞型7( transient receptor potential channel 7，TRPC7) 均可以被低滲刺激引起的細(xì)胞容積脹大所激活［17］。Numata 等［18］在人上皮HeLa 細(xì)胞中證實(shí)，TRP 通道家族黑色素抑素類亞 型 7 ( transient receptor potential melastatin 7，TRPM7) 的激活和介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的RVD 過程。

TRP 通道家族活動(dòng)的調(diào)節(jié)因素較多。胞漿Ca2+濃度過度升高可抑制TRPV4 的活動(dòng)，表明該通道的活動(dòng)調(diào)控過程中可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)［19］。Kerrigan等［10］對牛關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，低滲剌激在急性分離和貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞中導(dǎo)致的胞漿Ca2+濃度升高程度和RVD 比例均相同，然而，介導(dǎo)胞漿Ca2+濃度升高的主要離子通道對通道阻斷劑Gd3+的敏感性不同，提示細(xì)胞形態(tài)或狀態(tài)不同時(shí)，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流的通道類型可能不同。因此，介導(dǎo)RVD 過程中胞漿Ca2+濃度升高的通道類型除與細(xì)胞類型有關(guān)，可能還受細(xì)胞狀態(tài)影響。總之，TRP 通道是一類重要的Ca2+內(nèi)流途徑，在低滲刺激下TRP 通道開放介導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，引起胞漿Ca2+濃度升高，從而可以調(diào)節(jié)RVD 過程中其它Ca2+依賴性通道的活動(dòng)。

2.3 胞漿Ca2+濃度升高對K+通道和RVD 的影響

低滲刺激引起的胞漿Ca2+濃度升高對RVD 的調(diào)節(jié)是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能涉及到對多種酶活性、信號分子的生成以及對直接離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)活動(dòng)的調(diào)節(jié)。由于Ca2+依賴性K+通道的活動(dòng)直接受到胞漿Ca2+濃度所調(diào)節(jié)，低滲刺激導(dǎo)致的胞漿Ca2+濃度升高可以導(dǎo)致通道的激活。然而，Ca2+濃度升高對整體細(xì)胞水平RVD 過程的影響往往要復(fù)雜得多。例如在心肌細(xì)胞中，Ca2+濃度改變對RVD 起到雙向調(diào)節(jié)作用，低滲剌激導(dǎo)致的胞漿Ca2+濃度升高促進(jìn)RVD，而Ca2+濃度的升高也使活性氧簇( reactive oxygen species，ROS) 生成增多，對RVD 過程產(chǎn)生抑制［20］。

3 RVD 過程中胞漿pH 值的變化及影響

3.1 RVD 過程中胞漿pH 值的變化 幾乎所有的細(xì)胞都具有比較完善的pH 值調(diào)節(jié)機(jī)制，在外界刺激以及多種生命活動(dòng)過程中維持細(xì)胞內(nèi)pH 值( intracellular pH，pHi) 的穩(wěn)定。然而，多種細(xì)胞在低滲刺激后的RVD 過程中存在pHi降低。Lo 等［21］在骨肉瘤ROS17/2.8 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，低滲刺激可以使細(xì)胞pHi降低約0.7，并且當(dāng)細(xì)胞處于低滲環(huán)境中時(shí)pHi持續(xù)處于低水平。在腎上皮A6 細(xì)胞中，低滲刺激同樣可以使細(xì)胞pHi降低，并且細(xì)胞內(nèi)的酸化可以抑制RVD［22］。

3.2 Ca2+在pH 降低中的作用 RVD 過程中出現(xiàn)的pHi降低與胞漿Ca2+濃度升高之間存在一定因果關(guān)系。Souza 等［23］對雞胚心肌細(xì)胞的研究表明，低滲刺激引起的pHi降低可能與胞漿Ca2+濃度升高使線粒體膜上的K+/H+和Ca2+/H+交換體活動(dòng)增加，將線粒體中的H+轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿有關(guān)。Kuo 等［24］在大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高可以導(dǎo)致pHi降低，同時(shí)可以激活一種pHi敏感的Ca2+依賴性質(zhì)子通道，將細(xì)胞內(nèi)的H+釋放到細(xì)胞外。

3.3 pH 值對TRP 通道的影響 pHi降低可以使細(xì)胞H+向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)增加，有助于pHi恢復(fù)，同時(shí)也使細(xì)胞外pH 值( extracellular pH，pHe) 降低，對一些通道的活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控。Semtner 等［25］在人胚腎HEK－293 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，pHe降低一方面可以使TRPC4 和TRPC5 通道的活動(dòng)增加，另一方面也抑制TRPC6 通道活動(dòng)。Cha 等［26］對倉鼠卵巢細(xì)胞的研究表明，pHi降低可以直接導(dǎo)致TRPV5 通道構(gòu)像發(fā)生改變，使通道開放機(jī)率和單通道電導(dǎo)降低。因此，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高在一定程度上也受到pH 值調(diào)節(jié)?？傊喾N類型動(dòng)物細(xì)胞的RVD 過程中都存在pHi降低，這一特征性改變與胞漿Ca2+濃度升高之間可以互相進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而對RVD 過程產(chǎn)生影響。

3.4 pH 改變對K+通道的影響 參與RVD 過程的多種 K+通道活動(dòng)受到 pHi和/或 pHo調(diào)節(jié)。Hougaard 等［27］對腹水瘤Ehrlich 細(xì)胞的研究表明，參與RVD 過程的TASK 通道活動(dòng)受細(xì)胞內(nèi)、外pH 值改變調(diào)節(jié)。pH 值升高和降低可以分別激活和抑制IK，vol，pH 值升高時(shí)通道開放數(shù)量增多，低滲激活I(lǐng)K，vol的潛伏期縮短，甚至在等滲條件下自發(fā)激活。另外，部分研究提示Ca2+依賴性的K+通道也具有pH 敏感性。Pedersen 等［28］在HEK－293 細(xì)胞中觀察到IK1 通道活動(dòng)具有pHi敏感性，而pHi降低使通道活動(dòng)減弱，低pHi時(shí)提高胞漿Ca2+濃度也未能恢復(fù)通道活動(dòng)。Church 等［29］對大鼠胚胎海馬神經(jīng)元細(xì)胞BK 通道的研究中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度相同的條件下，pHi升高可以增加通道開放頻率，反之則導(dǎo)致通道開放頻率降低。

3.5 整體細(xì)胞水平研究K+通道調(diào)節(jié)的困難和可能性 參與RVD 過程的多種K+通道具有pH 敏感性，因此，細(xì)胞pHi調(diào)節(jié)能力正常的情況下在RVD 過程中細(xì)胞整體IK，vol水平可能會(huì)發(fā)生衰減。目前，對IK，vol特性的研究主要是基于膜片鉗技術(shù)，由于對RVD 和pH 調(diào)節(jié)能力影響較大，尚未觀察到RVD 過程中IK，vol的衰減過程。然而，在完整植物細(xì)胞的研究中直接觀察到質(zhì)子泵活動(dòng)對K+通道活動(dòng)的調(diào)節(jié)。Shabala 等［30］采用自參比離子選擇性微電極技術(shù)在無損傷的情況下對植物跨膜離子流的研究中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)子泵活動(dòng)產(chǎn)生的H+離子流和K+通道開放形成K+離子流的時(shí)相恰好相反，H+離子流為最小值時(shí)正好對應(yīng)K+離子流的峰值，反之亦然。由于質(zhì)子泵和K+通道活動(dòng)均可能受pHi影響，H+和K+離子流的交替增減現(xiàn)象可能是pHi波動(dòng)對質(zhì)子泵和K+通道活動(dòng)調(diào)控的結(jié)果，這為我們進(jìn)行整體細(xì)胞水平離子通道活動(dòng)調(diào)節(jié)提供了新的思路。

4 小結(jié)與展望

低滲刺激下，細(xì)胞容積脹大使TRP 通道激活，胞外Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致胞漿Ca2+濃度升高，使Ca2+依賴性K+通道激活促進(jìn)RVD 的發(fā)生，同時(shí)也引起pHi的降低，后者又對參與RVD 過程的各種K+通道產(chǎn)生抑制作用。細(xì)胞膜上TRP 通道的活動(dòng)又受到胞漿Ca2+濃度和pH 的調(diào)節(jié)?？梢?，RVD 過程中胞漿Ca2+濃度和pHi的改變構(gòu)成一個(gè)反饋系統(tǒng)，從而形成K+通道活動(dòng)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。對整體細(xì)胞水平的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控系統(tǒng)的研究有助于我們在科研和臨床工作過程中采用聯(lián)系、系統(tǒng)的方法進(jìn)行分析，尋找調(diào)控系統(tǒng)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而更有針對性地施加干預(yù)措施。

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