鴨疫里氏桿菌外膜蛋白研究進展

杜金玲，牟 巍，趙亞榮，郭書豪，盧會英

(北京大北農(nóng)動物醫(yī)學研究中心，北京 100097)

鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的一種接觸性傳染病。多見于1～8周齡雛鴨，尤以2～3周齡雛鴨最易感，死亡率一般在5%～75%，當環(huán)境惡劣或混合感染其他疫病時死亡率可達90%以上，耐過鴨生長不良，失去飼養(yǎng)價值。該病廣泛分布于世界各養(yǎng)鴨國家和地區(qū)，不具有季節(jié)性，造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的疾病之一［1－3］。RA血清型較多，國際上已報道了21個，程安春等在此基礎上又發(fā)現(xiàn)了4個新的血清型［4］，我國目前發(fā)現(xiàn)存在16個血清型。OMPs(Outer Membrane Proteins)是RA的外膜蛋白，具有良好的免疫原性，可同時誘導機體的體液免疫和細胞免疫，具有異種血清型的免疫交叉保護作用，是一種潛在的共同保護性抗原［5］。同時，OMPs與細菌毒力密切相關，在診斷及疫苗研制中都具有重要的應用價值［6］，本文就RA OMPs研究進展進行簡要綜述，以期為RA致病機制的研究、新疫苗和診斷試劑的開發(fā)提供一些參考。

1 RA OMP結(jié)構(gòu)及其功能

1.1 結(jié)構(gòu)保守性 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的RA外膜蛋白A(Outer Membrane Protein A，OMPA)基因序列，魏秀麗等［7］在其高度保守區(qū)設計一對特異性引物，分別擴增了8株RA中國大陸分離株的OMPA基因并進行序列分析，證實RA OMPA基因均為由1164個堿基組成的ORF，編碼387個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，起始密碼子均為ATG，終止密碼子均為TAA，其核苷酸序列非常保守，同源性高達88.2% ～100%，氨基酸同源性達到 88.9% ～100%。張 煒［8］根 據(jù) NCBI檢 索 所 得 的 RA ATCC11845株的2個OMPA序列用軟件DNA Star分析后發(fā)現(xiàn)，2個OMPA均由1164個堿基組成，其中N端630個堿基完全相同，C端533個堿基存在多處不同，推測這630 bp為RA不同血清型的共有序列，并按此序列設計一對引物，用RA1型北京參考株擴增，產(chǎn)物測序結(jié)果與預期一致。

同所有革蘭氏陰性菌的OMPA結(jié)構(gòu)相似，RA的OMPA基因也包含1個C－端保守區(qū)以及1個可變的N－端，編碼外膜蛋白的基因存在于RA標準株和所有血清型參照株中。Bin Huang［9］等完整表達了RA ATCC11845株的OMPA基因，15株臺灣RA分離株、8株參考血清型菌株和國外OMPA序列差異度范圍為0～10.5%。其原因極有可能是不同血清型OMPA基因C端及閱讀框外側(cè)序列差異較大。外膜蛋白只有胞外區(qū)才能刺激產(chǎn)生抗體，膜內(nèi)區(qū)序列不必考慮。

與其他細菌有所不同，RA的OMPA具有6個EF－手銬結(jié)合域和2個PEST結(jié)構(gòu)域，這些基序(motif)的出現(xiàn)表明它們在外膜蛋白毒力方面有重要作用，而且編碼外膜蛋白的基因存在于RA標準株和所有血清型參照株中。盡管各血清型RA之間存在一定的遺傳性差異，但這并不影響外膜蛋白的強抗原特性［10］。由于其氨基酸序列較保守，各血清型間差異較小，所以認為外膜蛋白在RA感染的血清學檢測中很有意義，而且在亞單位疫苗的研制中也具潛在的應用價值［11］。

1.2 毒力 外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要結(jié)構(gòu)，占其全部組成的1/2，除在維持外膜結(jié)構(gòu)、保證物質(zhì)運輸?shù)确矫婢哂兄匾饔?，還與細菌毒力密切相關［12－15］。劉燕等［16］首次應用蛋白質(zhì)組學雙向電泳技術，對血清2型RA(RA2)強毒株及其體外傳200代(RA200)獲得的弱毒菌株的外膜蛋白進行比較蛋白質(zhì)組學研究。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，RA2及RA200外膜蛋白表達存在差異，差異表達蛋白質(zhì)點數(shù)達到5倍以上的有3個蛋白，其中1個為熱休克蛋白Hsp20家族成員，該蛋白質(zhì)的改變會導致膜結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，進一步會導致細菌的某些生物學特性發(fā)生改變;另外2個蛋白為轉(zhuǎn)座酶(transposase)，轉(zhuǎn)座酶是催化轉(zhuǎn)座因子從染色體原來的位置切離下來，插入到染色體新的位置的一種酶，革蘭氏陰性菌的轉(zhuǎn)座子與細菌的毒力密切相關，強、弱毒株轉(zhuǎn)座酶表達量差異可能與二者毒力變化密切相關。

GXRA01(RA血清1型)和GXRA07(RA血清2型)株菌毒力存在差異，前者的致病性高于后者。潘艷等［17］應用雙向電泳和質(zhì)譜技術對上述2株菌體蛋白進行比較蛋白質(zhì)組學研究，分析2株RA菌體蛋白表達特點，結(jié)果經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定出17個蛋白點中有7個為OMPA，推測這些差異表達蛋白與血清分型及毒力的不同密切相關。

1.3 免疫原性 外膜蛋白在革蘭氏陰性菌引起易感動物發(fā)病的過程中起著重要的作用。很多細菌的外膜蛋白具有免疫原性且能誘導保護性免疫反應已得到證實［18－21］。RA OMPA 基因結(jié)構(gòu)的保守性同樣促使人們以極大的興趣研究其免疫學功能，以期解決RA交叉保護的問題，為進一步篩選治療藥物提供新的平臺［22－23］。

通過提取RA的OMPA、Western Blot檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外膜蛋白與免疫鴨血清和自然感染后康復鴨血清出現(xiàn)較強的陽性反應，而與感染發(fā)病的瀕死鴨血清反應較弱，表明外膜蛋白可能是RA的免疫原性蛋白之一。經(jīng)甲醛滅活RA1外膜蛋白的菌苗能很好地抵抗同源菌的攻擊，100℃處理1 h或用胰蛋白酶處理后完全喪失免疫原性，經(jīng)脂酶處理后喪失部分免疫原性，證明了外膜蛋白對于抵抗RA感染有一定的保護作用，是RA的主要免疫原［24－25］。用超速離心法提取5種血清型的RA外膜蛋白，采用SDS－PAGE技術對其電泳圖譜進行比較分析，并采用免疫印跡技術對其免疫原性及是否存在交叉免疫原性進行初步研究，結(jié)果表明其外膜蛋白的電泳圖譜具有一定相似性，對主要外膜蛋白條帶的組成進行分析后可將這5種血清型的RA外膜蛋白分為3個外膜蛋白型，同時也表明不同血清型的菌株之間存在相同的外膜蛋白型。使用抗RA外膜蛋白陽性鴨血清、抗RA陽性鴨血清和抗RA陽性雞血清對RA外膜蛋白抗原進行免疫印跡檢測，表明5種血清型的RA外膜蛋白均有免疫原性［26］。劉燕等分析了1型、2型、10型與11型四種血清型RA外膜蛋白的電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)相同血清型的電泳圖譜相似，不同血清型的電泳圖譜差異較大。RA外膜蛋白抗原在不同血清型菌株暴露的程度有所不同，只有位于外膜外部的表位，才可能在細菌體內(nèi)生長，并刺激機體產(chǎn)生相應的免疫反應或保護性抗體，所以1型、2型、10型與11型RA外膜蛋白與各自同型的抗血清反應后均出現(xiàn)了多條陽性反應帶，免疫原性較強的外膜蛋白顯示的條帶較強，免疫原性稍差的反應條帶較弱。但不同血清型的電泳圖譜雖存在差異，卻仍有相似［27］，試驗中四種血清型在44、69 KDa處有交叉反應的蛋白多肽，此蛋白多肽可能為具有交叉保護作用的免疫原。

外膜蛋白的免疫原性作用在多種細菌中已被確證，而且某些細菌的外膜蛋白已被應用于試制疫苗，其中部分編碼外膜蛋白基因已被克隆并進行重組表達。Subramaniam等［10］報道了RA15型基因組文庫的構(gòu)建，從中篩選出了具有免疫原性的42 ku的OMPA，并且在大腸桿菌中克隆和表達了此種外膜蛋白?；舸涿罚?8］等參照已知的全基因序列設計特異性引物克隆RA OMPA并進行表達，經(jīng)測序比較，與標準序列的核苷酸同源性達99.8%，Western Blot檢測 RA1、RA2、RA10、RA11 型全菌兔血清呈陽性，而陰性兔血清不反應，說明表達蛋白具有很強的免疫反應特異性，并具有種的特異性。

2 OMP在RA診斷上的應用

由于RA不同血清型之間基本無交叉保護性，這一特性為該病的免疫和快速診斷帶來了困難。因此找到該菌不同血清型的共同抗原，并以此抗原為基礎建立血清學檢測方法，使得快速鑒定RA的感染成為可能，是當前RA研究的重要方向。

OMPA是RA各血清型所共有的蛋白，并且已經(jīng)證實該蛋白在各地各型菌株中具有保守性，因此利用PCR方法檢測OMPA部分基因，可以作為該菌鑒定的一種方法。胡清海等［29］根據(jù)已發(fā)表的RA15型CVL110/89株編碼42 KDa主要外膜蛋白的基因序列設計引物，建立PCR方法，對7個血清型的RA純培養(yǎng)菌及野外病死鴨病料組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)7個血清型的RA純培養(yǎng)菌DNA均可擴增出809 bp的DNA片段，而對照的大腸桿菌和沙門氏菌純培養(yǎng)菌DNA擴增結(jié)果為陰性，由此表明，針對OMPA建立的PCR方法可用于RA的鑒定和快速診斷(取腦組織)。程龍飛［30］等應用該法對42株RA進行了檢測，全部可以擴增出特異性條帶，且在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)最低檢出量為1 pg，證明該方法不僅敏感，而且適用于多種不同RA菌株的鑒定。楊建遠等［31］根據(jù) GenBank中 25株 RA的OMPA基因序列，在其高度保守區(qū)設計了一對特異性引物，也成功地建立了RA快速PCR檢測方法。

RA的OMPA結(jié)構(gòu)高度保守，且具有很強的免疫原性，能誘導產(chǎn)生抗體。這一特性也被用于研制單克隆抗體進行診斷。覃志初［32］等首次嘗試了RA外膜蛋白McAb的研制，采用高速離心、超聲裂解和化學試劑作用的方法提取RA外膜蛋白，濃度可達10 μg/mL，作為間接ELISA的包被抗原，用于檢測RA單抗以及融合前的加強免疫，該研究同時建立了相應的篩選體系，為外膜蛋白免疫原性蛋白質(zhì)及診斷抗原等相關研究奠定了基礎。

霍翠梅［28］等用表達純化的RA OMPA作為包被抗原，建立了檢測鴨疫里默氏桿菌的間接ELISA方法。實驗表明，該法特異性好、重復性高，相比以往以破碎的菌體進行包被只能檢測一種血清型的抗體，以OMPA作為包被抗原可以檢測多種血清型抗體，而且提高了檢測效率。

3 OMP在RA疫苗領域的研究

外膜蛋白廣泛存在于革蘭氏陰性菌群中，作為細菌的免疫原蛋白之一，它能在無免疫佐劑輔助的情況下誘導特異性的體液和細胞毒性反應，而且還能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉提呈，具有潛在的免疫載體功能，可以提高機體的免疫應答，具有較強的免疫保護作用，已廣泛用于疫苗的研究和開發(fā)［33］。由于各血清型交叉保護力差，應用單一菌株滅活苗保護作用有限，鑒于OMPA在不同血清型中均具有良好的免疫原性，可制成一種針對多血清型的細菌疫苗，其在制備亞單位疫苗研究中具有良好前景。

蘇敬良等［24］用提取的RA1型外膜蛋白加弗氏佐劑制成疫苗，免疫北京鴨后，可誘導產(chǎn)生較高水平的抗體，且抗體維持時間較長。經(jīng)過兩次免疫后，對同源細菌攻擊的保護率為100%。程安春等［25］提取RA2型的外膜蛋白，免疫印跡證實，RA2型的分子質(zhì)量為40000 u的外膜蛋白與免疫鴨血清呈較強的陽性反應，是主要免疫原蛋白。用分離的外膜蛋白加上弗氏佐劑制備的亞單位疫苗免疫雛鴨后，可誘導產(chǎn)生高水平的抗體，免疫鴨對同源RA的攻擊可產(chǎn)生100%的免疫保護。Pathanasop Hon等［34］應用飽和硫酸銨沉淀法和SepHadex G－200凝膠柱提純了RA1的外膜蛋白，對14日齡雛鴨一次性皮下注射氫氧化鋁吸附的RA蛋白(100 μg/只)，免疫后 21 d攻以同源菌(5×109CFU/只)，可獲得100%的保護，這為研制和開發(fā)RA蛋白苗奠定了基礎。

幾乎所有RA血清型均只與同源抗血清發(fā)生特異性反應，不同血清型對異型強毒沒有保護或保護力很低，此特點為RA的預防工作帶來了極大困難。但劉燕等發(fā)現(xiàn)不同血清型的電泳圖譜雖存在差異，但仍有相似［27］，這是由于在不同血清型的菌株中存在有交叉反應的蛋白多肽，推測其可能為具有交叉保護作用的免疫原。Bin Huang［9］等對表達的RA ATCC11845株的OMPA進行免疫保護性實驗，發(fā)現(xiàn)其可以與多個血清型RA陽性血清結(jié)合，但其單獨作為疫苗免疫雛鴨后，卻不能對攻毒提供足夠的免疫保護力，其原因可能是該蛋白抗原性較弱，使用佐劑可增強其免疫保護力，其原因有待進一步研究。張煒［8］用異于 ATCC11845株和CVL110/89株的RA擴增出了與前兩者完全相同的序列，而且該擴增序列與質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化并表達的蛋白，也具有與多種血清型RA陽性血清結(jié)合的能力，與Bin Huang等的結(jié)果相符。這也證明了以OMPA為基礎研制一種RA疫苗來同時保護雛鴨免受多種血清型RA感染的策略具有可行性。

RA病給養(yǎng)鴨業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，引起越來越多的關注。各血清型之間缺乏交叉免疫，而OMPs作為不同血清型的共同免疫蛋白，可能與RA的毒力存在一定的關系，深入研究將有助于揭示細菌的致病機制，還可用以探索簡便快速特異的診斷方法進行菌種鑒定，更有望被制成一種可以針對多RA血清型的疫苗。

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