代謝組學(xué)及其在藥物安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)展

畢言鋒，汪 霞，徐士新，肖希龍

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100091)

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后出現(xiàn)的一門新學(xué)科，已成為系統(tǒng)生物學(xué)(systemic biology)的重要組成部分。與其他組學(xué)不同，代謝組學(xué)是對(duì)生物或細(xì)胞中所有低分子量(相對(duì)分子量小于1000)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析的一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法。1998年，Tweeddale等在大腸桿菌代謝研究中將代謝物組(Metabolome)簡單定義為“代謝物的整體(global metabolite pool)”，并發(fā)現(xiàn)代謝物組分析是一種揭示細(xì)胞代謝和整體調(diào)節(jié)的新手段［1］。1999年，Nicholson等在利用NMR進(jìn)行大量生物代謝研究的基礎(chǔ)上提出了metabonomics的概念，被認(rèn)為是代謝組學(xué)學(xué)科的正式誕生［2］。metabonomics(代謝組學(xué))主要研究生物體對(duì)生物刺激或基因變異所引起的整體代謝物動(dòng)態(tài)響應(yīng)，更關(guān)注復(fù)雜多細(xì)胞體系隨時(shí)間的系統(tǒng)變化，早期主要應(yīng)用于疾病診斷和藥物篩選等領(lǐng)域。2000年，F(xiàn)iehn在植物代謝研究中使用了metabolomics(代謝物組學(xué))的概念［3］，主要用于無偏差、非靶向的定性和定量分析生物體所有小分子代謝產(chǎn)物［4］，被認(rèn)為是靜態(tài)的代謝物組分析。Nicholson教授認(rèn)為metabonomics和metabolomics的區(qū)別更多表現(xiàn)在定義上，而非技術(shù)層面上，相關(guān)的技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮趯?shí)際應(yīng)用中已經(jīng)逐漸融合統(tǒng)一［5］。目前，代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病診斷［6］、新藥研發(fā)［7］、食品安全［8］、植物代謝［9］和微生物代謝［10］研究等。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組時(shí)代的來臨，代謝組學(xué)方法被認(rèn)為是未來科學(xué)探索的新途徑之一，將有助于人們?cè)诨蛩缴险J(rèn)識(shí)內(nèi)源性物質(zhì)變化和藥物作用的聯(lián)系［11－12］。

1 代謝組學(xué)的研究方法

完整的代謝組學(xué)流程包括樣品采集和預(yù)處理、樣品分析及數(shù)據(jù)分析處理等，其研究平臺(tái)主要由樣品分析平臺(tái)和數(shù)據(jù)處理平臺(tái)構(gòu)成。

1.1 樣品分析平臺(tái) 在代謝組學(xué)的研究中最常見的樣品分析工具是核磁共振儀(NMR)和質(zhì)譜儀(MS)［13－14］。核磁共振儀(特別是1H － NMR)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)樣品的非破壞性、非選擇性分析，滿足了代謝組學(xué)中對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測的目標(biāo)。但是，它有靈敏度低、分辨率不高等缺陷［15］。氣相色譜聯(lián)用儀(GC/MS)主要優(yōu)勢(shì)在于能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考、比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫，可以方便地得到待分析組分的定性結(jié)果;其局限性表現(xiàn)在GC只能對(duì)揮發(fā)性組分實(shí)現(xiàn)直接分析，從而得不到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息［16］。21世紀(jì)以來，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC/MS)逐漸被廣泛地用于代謝組學(xué)研究中［17－18］。與 GC/MS 相比，LC/MS 技術(shù)預(yù)處理相對(duì)簡單，可以滿足生物體內(nèi)大部分小分子代謝物的高通量分析。目前，超高效液相色譜(UPLC)與高分辨質(zhì)譜(如飛行時(shí)間質(zhì)譜)聯(lián)用已經(jīng)成為代謝組學(xué)研究的有力工具［19］。超高效液相色譜儀采用粒徑為1.7 μm的填料和能承受更大壓力(15000 psi)的液相色譜系統(tǒng)，極大地提高了分離能力和靈敏度。飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF－MS)可以得到更精確的分子質(zhì)量信息，有助于對(duì)代謝物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確分析。

1.2 數(shù)據(jù)處理平臺(tái) 應(yīng)用NMR或MS得到的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)是海量的多變量數(shù)據(jù)信息，需要利用模式識(shí)別(PR，pattern recognition)技術(shù)進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析，將數(shù)據(jù)降維，然后對(duì)樣本分類或?qū)ふ疑飿?biāo)志物(biomarker)，用來解釋代謝表型(metabolic phenotypes)與基因變異或外界刺激(如疾病或藥物)的關(guān)系［20－21］。常用的模式識(shí)別技術(shù)包括無監(jiān)督(unsupervised)方法和有監(jiān)督(supervised)方法兩類。無監(jiān)督的模式識(shí)別方法的特點(diǎn)是不把描述的樣本特征量與分類屬性關(guān)聯(lián)起來建立模型，直接將具有相似特征的樣本進(jìn)行分類，采用相應(yīng)的可視化技術(shù)直觀地表達(dá)出來。主要的無監(jiān)督模式識(shí)別方法包括簇類分析(Hierarchical Cluster analysis)、主成分分析(Primary component analysis，PCA)和非線形映射(Nonlinear Mapping，NLM)等。有監(jiān)督模式識(shí)別方法是在已有分類信息的基礎(chǔ)上，建立樣本的特征屬性描述與樣本分類目標(biāo)之間的關(guān)系，使各類樣品間達(dá)到最大的分離，并利用所建立的多參數(shù)模型對(duì)未知數(shù)據(jù)進(jìn)行辨識(shí)、歸類和預(yù)測。主要的有監(jiān)督模式識(shí)別方法包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANNs)、偏最小二乘(PLS)、軟獨(dú)立建模分類法(SIMCA)、偏最小二乘－判別分析(PLS－DA)和正交偏最小二乘－判別分析(OPLS－DA)等。在代謝組學(xué)研究中，一般先采用無監(jiān)督模式識(shí)別方法(如PCA)將未知樣品進(jìn)行分類，初步尋找代謝指紋譜的差異組分。然后，在建立初步的分類模型的基礎(chǔ)上，有監(jiān)督模式識(shí)別方法(如OPLS－DA)能夠消除各種非實(shí)驗(yàn)因素的干擾，縮小臨床樣本的個(gè)體差異，減少系統(tǒng)誤差，篩選可能的生物標(biāo)志物，最終把數(shù)學(xué)結(jié)果回歸成有化學(xué)意義的參數(shù)。

2 代謝組學(xué)方法在藥物毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

在藥物的安全評(píng)價(jià)中，傳統(tǒng)的藥物毒理學(xué)將藥物暴露與藥物引起的各種損傷終點(diǎn)直接聯(lián)系起來進(jìn)行研究，對(duì)于藥物損傷的分子機(jī)制了解極其有限。代謝組學(xué)是利用高通量檢測技術(shù)在代謝物的整體水平上檢測機(jī)體在藥物暴露后的各種生理生化指標(biāo)，這些指標(biāo)幾乎涵蓋毒理作用發(fā)生的所有的環(huán)節(jié)，再結(jié)合傳統(tǒng)的病理學(xué)終點(diǎn)，可以對(duì)藥物的毒性作用機(jī)制進(jìn)行深入的了解［22］。

在毒理代謝組學(xué)研究方面，Nicholson等最早將NMR與模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合檢測代謝表型中的動(dòng)態(tài)變化，并應(yīng)用于藥物毒理標(biāo)示物的研究［22］。由Nicholson教授主持，輝瑞等五大醫(yī)藥公司參與的Consortium for Metabonomic Toxicology(COMET)項(xiàng)目是利用代謝組學(xué)方法預(yù)測化學(xué)品毒性最有影響和代表性的研究。該研究利用NMR技術(shù)分析了約150種藥物(或化學(xué)品)對(duì)嚙齒動(dòng)物尿液、血液和部分組織代謝組的影響，證明代謝組學(xué)方法應(yīng)用于藥物毒理研究的可行性和穩(wěn)定性，并建立了用于臨床前候選化合物的肝臟和腎臟毒性預(yù)測篩選的專家系統(tǒng)［23－24］。美國食品與藥品管理局(FDA)的“關(guān)鍵路徑機(jī)遇報(bào)告”(Critical Path Opportunities Report)認(rèn)為，代謝組學(xué)是發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟和心臟等器官損壞的新生物標(biāo)志物的重要實(shí)驗(yàn)方法，有助于更深入地理解藥物毒性和疾病發(fā)生的機(jī)制［25］。目前，F(xiàn)DA已經(jīng)接受代謝組學(xué)研究的結(jié)果作為新藥申報(bào)和注冊(cè)的重要參考指標(biāo)。

近年來，基于NMR和MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法逐漸被用于藥物毒理學(xué)研究中。Coen等采用基于高分辨NMR的代謝組學(xué)方法研究了對(duì)乙酰氨基酚的毒性作用，結(jié)果表明，高劑量的乙酰氨基酚會(huì)影響三羧酸循環(huán)中的丙酮酸代謝，并阻礙肝微粒體脂肪酸的 β －氧化過程，從而導(dǎo)致肝毒性［26］。Kumar等利用LC－TOFMS對(duì)降血脂藥阿托伐他汀代謝組學(xué)研究表明，雌酮、腎上腺皮質(zhì)酮、脯氨酸、胱氨酸和組氨酸等為阿托伐他汀潛在的肝毒性標(biāo)示物［27］。Xie等利用基于UPLC－QTOFMS的代謝組學(xué)方法，并結(jié)合血液生化分析和病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)高劑量的三聚氰胺、低劑量的三聚氰胺和三聚氰酸混合物都具有較強(qiáng)的腎毒性及病理損害，主要是影響了色氨酸、多胺和酪胺的代謝及腸道菌群組成［28］。

代謝組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)研究思想與中醫(yī)藥的整體治療觀念是一致的，因此，代謝組學(xué)方法也被應(yīng)用于中藥毒性評(píng)價(jià)的研究中。Li等利用NMR技術(shù)研究中藥制品黑順片的毒理效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)尿液中的牛磺酸和N－三甲胺氧化物與對(duì)照組相比明顯減少，而檸檬酸鹽、戊酮異二酸、琥珀酸鹽和馬尿酸鹽的含量相對(duì)增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)毒性效應(yīng)具有劑量依賴性和積累效應(yīng)［29］。Chen等基于LC－MS和多元統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸所致的快速進(jìn)行性腎衰竭(rapid progressive renal failure)與代謝表型的變化有明確的聯(lián)系［30］。

以上的研究表明，毒理代謝組學(xué)方法與常規(guī)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法具有較好的一致性，并且其敏感性優(yōu)于常規(guī)毒理學(xué)檢測，為藥物安全評(píng)價(jià)提供了新思路和新途徑。

3 代謝組學(xué)在藥物代謝研究中的應(yīng)用

從代謝組學(xué)的角度，生物體攝入一定劑量的藥物后，代謝物組(metabolome)包括自身代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝物和藥物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后的外源代謝物。毒理代謝組學(xué)的主要研究對(duì)象是外源物毒理作用引起的生物體內(nèi)源性代謝物變化。理論上講，單次低劑量給藥時(shí)，藥物對(duì)生物體內(nèi)源代謝的影響很小，給藥前后的體液樣品代謝組的主要差別為藥物代謝產(chǎn)物。在藥物代謝組學(xué)方法中，利用模式判別等多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，給藥前后的樣品可以被顯著區(qū)別開，而給藥后樣品組中的對(duì)分組貢獻(xiàn)較大的就是藥物主要代謝物［31］。

由于具有較高的分辨率和靈敏度，并易于進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證等優(yōu)點(diǎn)，LC/MS分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中藥物代謝物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。2003年，Plumb等首次嘗試將高分辨質(zhì)譜技術(shù)和多元數(shù)據(jù)分析方法應(yīng)用于藥物代謝物的篩選，將空白和給藥樣品的LC－QTOFMS數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，在復(fù)雜的質(zhì)譜信息中消除了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，在藥物結(jié)構(gòu)未知的情況下，鑒定出了藥物代謝產(chǎn)物［32］。Chen等用代謝組學(xué)方法對(duì)雜環(huán)胺PhIP的體內(nèi)代謝進(jìn)行了研究，檢測到17種PhIP代謝，其中8種為其他方法未檢測到的新代謝產(chǎn)物［33］。Sun等應(yīng)用基于LC/MS的代謝組學(xué)方法，快速鑒定了托卡朋(Tolcapone)的16種體內(nèi)代謝物，其中，6種代謝物為首次發(fā)現(xiàn)［34］。以上研究表明，基于代謝組學(xué)方法的藥物代謝研究將高分辨分析儀器(如UPLC－TOFMS)和多元數(shù)據(jù)分析技術(shù)相結(jié)合，不局限于已知的特定代謝途徑，對(duì)藥物代謝物進(jìn)行非靶向的全面篩選，有助于發(fā)現(xiàn)一些用傳統(tǒng)方法無法檢測到的新代謝產(chǎn)物，為藥物體內(nèi)代謝研究提供了一種新的途徑。

4 代謝組學(xué)在獸藥安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用前景

在新獸藥研發(fā)和安全評(píng)價(jià)中，代謝組學(xué)方法將有廣泛的應(yīng)用前景。首先，代謝組學(xué)參數(shù)比傳統(tǒng)的毒理學(xué)生化指標(biāo)更靈敏，因此，采用毒理代謝組學(xué)方法可以研究獸藥的不同劑量對(duì)動(dòng)物內(nèi)源性代謝物的影響，有助于更準(zhǔn)確深入地了解獸藥的毒理學(xué)機(jī)制，確定獸藥作用機(jī)理和安全劑量，從而更有效地保障動(dòng)物源食品安全。代謝組學(xué)技術(shù)可以為中獸藥藥理藥效研究提供科學(xué)依據(jù)，也為中獸藥的安全評(píng)價(jià)提供一種新的途徑。另外，作為一種非靶向、無偏的篩選技術(shù)，代謝組學(xué)方法可以用于獸藥體內(nèi)代謝和殘留標(biāo)示物的研究。在獸藥殘留監(jiān)控中，禁用藥物(如類固醇激素、β－受體激動(dòng)劑)的新化合物或多藥物低劑量聯(lián)合使用往往無法被常規(guī)的檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)。近年來，有研究嘗試?yán)么x組學(xué)方法篩選禁用藥物長期使用后產(chǎn)生的內(nèi)源性生物標(biāo)示物［35］，為獸藥殘留監(jiān)控提供了一種全新的檢測技術(shù)。

代謝組學(xué)研究現(xiàn)在處于快速發(fā)展的階段，無論是樣品分析和數(shù)據(jù)處理方法，還是多學(xué)科交叉應(yīng)用都面臨著很多挑戰(zhàn)。同時(shí)，代謝組學(xué)方法僅僅是一個(gè)技術(shù)平臺(tái)，無法獨(dú)立進(jìn)行生物機(jī)制研究，只有與其他的學(xué)科(如分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等)相結(jié)合才能發(fā)揮其強(qiáng)大的作用。隨著代謝組學(xué)研究方法的不斷完善，其在藥物研究中應(yīng)用的深度和廣度會(huì)不斷增加，與蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄物組學(xué)整合，將為準(zhǔn)確全面地評(píng)價(jià)藥物安全性和藥理作用提供一種有力的工具。

［1］Tweeddale H，Notley － McRobb L，F(xiàn)erenci T.Effect of Slow Growth on Metabolism of Escherichia coli，as Revealed by Global Metabolite Pool(“Metabolome”)Analysis［J］.J Bacteriol，1998，180(19):5109 －5116.

［2］Nicholson J K，Lindon J C，Holmes E.‘Metabonomics’:Understanding the Metabolic Responses of Living Systems to Pathophysiological Stimuli via Multivariate Statistical Analysis of Biological NMR Spectroscopic Data［J］.Xenobiotica，1999，29(11):1181－1189.

［3］Fiehn O，Kopka J，D?rmann P，et al.Metabolite Profiling for Plant Functional Genomics［J］.Nat Biotechnol，2000，(11)18:1157－1161.

［4］Fiehn O.Metabolomics——the Link Between Genotypes and Phenotypes［J］.Plant Mol Biol，2002，48(1/2):155 － 171.

［5］Nicholson J K，Lindon J C.Systems Biology:Metabonomics［J］.Nature，2008，455(7216):1054 －1056.

［6］Ala－Korpela M.Critical Evaluation of1H NMR Metabonomics of Serum as a Methodology for Disease Risk Assessment and Diagnostics［J］.Clin Chem Lab Med，2008，46(1):27 －42.

［7］Wishart D S.Applications of Metabolomics in Drug Discovery and Development［J］.Drugs R D，2008，9(5):307 －322.

［8］Antignac J P，Courant F，Pinel G，et al.Mass Spectrometry －based Metabolomics Applied to the Chemical Safety of Food［J］.Trends in Analytical Chemistry，2011，30(2):292－301.

［9］Schauer N，F(xiàn)ernie A R.Plant Metabolomics:towards Biological Function and Mechanism［J］.Trends Plant Sci，2006，11(10):508－516.

［10］Mashego M R，Rumbold K，DeMey M，et al.Microbial Metabolomics:Past，Present and Future Methodologies［J］.Biotechnol Lett，2007，29(1):1 －16.

［11］Zerhouui E.The NIH Roadmap［J］.Science，2003，302(5642):63－72.

［12］Lindon J C，Holmes E，Nicholson J K.Metabonomics Techniques and Applications to Pharmaceutical Research＆Development［J］.Pharm Res，2006，23(6):1075 －1088.

［13］Lenz E M，Wilson I D.Analytical Strategies in Metabonomics［J］.J Proteome Res，2007，6(2):443 －458.

［14］Dunn W B，Ellis D I.Metabolomics:Current Analytical Platforms and Methodologies［J］.Trends in Analytical Chemistry，2005，24(4):285－294.

［15］Pan Z，Raftery D.Comparing and Combining NMR Spectroscopy and Mass Spectrometry in Metabolomics［J］.Anal Bioanal Chem，2007，387(2):525－527.

［16］Dettmer K，Aronov P A，Hammock B D.Mass Spectrometrybased Metabolomics［J］.Mass Spectrom Rev，2007，26(1):51－78.

［17］Lu W，Bennett B D，Rabinowitz J D.Analytical Strategies for LC－ MS － based Targeted Metabolomics［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2008，871(2):236 －242.

［18］Allwood J W，Goodacre R.An Introduction to Liquid Chromatography－mass Spectrometry Instrumentation Applied in Plant Metabolomic Analyses［J］.Phytochem Anal，2010，21(1):33－47.

［19］Want E J，Wilson I D，Gika H，et al.Global Metabolic Profiling Procedures for Urine Using UPLC － MS［J］.Nat Protoc，2010，5(6):1005－1018.

［20］Issaq H J，Van Q N，Waybright T J，et al.Analytical and Statistical Approaches to Metabolomics Research［J］.J Sep Sci，2009，32(13):2183－2199.

［21］Griffin J L.Metabonomics:NMR Spectroscopy and Pattern Recognition Analysis of Body Fluids and Tissues for Characterisation of Xenobiotic Toxicity and Disease Diagnosis［J］.Curr Opin Chem Biol，2003，7(5):648 －654.

［22］Nicholson J K，Connelly J，Lindon J C，et al.Metabonomics:a Platform for Studying Drug Toxicity and Gene Function［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(2):153 －161.

［23］Lindon J C，Nicholson J K，Holmes E，et al.Contemporary Issues in Toxicology the Role of Metabonomics in Toxicology and Its Evaluation by the COMET Project［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2003，187(3):137 －146.

［24］Nicholson J K，Keun H，Ebbels T.COMET and the Challenge of Drug Safety Screening［J］.J Proteome Res，2007，6(11):4098－4099.

［25］Karsdal M A，Henriksen K，Leeming D J，et al.Biochemical Markers and the FDA Critical Path:How Biomarkers May Contribute to the Understanding of Pathophysiology and Provide U－nique and Necessary Tools for Drug Development［J］.Biomarkers，2009，14(3):181－202.

［26］Coen M，Lenz E M，Nicholson J K，et al.An Integrated Metabonomic Investigation of Acetaminophen Toxicity in the Mouse U－sing NMR Spectroscopy［J］.Chem Res Toxico，2003，16(3):295－303.

［27］Kumar B S，Lee Y J，Yi H J，et al.Discovery of Safety Biomarkers for Atorvastatin in Rat Urine Using Mass Spectrometry Based Metabolomics Combined with Global and Targeted Approach［J］.Anal Chim Acta，2010，661(1):47 －59.

［28］Xie G，Zheng X，Qi X，et al.Metabonomic Evaluation of Melamine － Induced Acute Renal Toxicity in Rats［J］.Journal of Proteome Research，2010，9(1):125–133.

［29］Li L，Sun B，Yan X，et al.Metabonomics Study on the Toxicity of Hei－ Shun － Pian，the Processed Lateral Root of Aconitum Carmichaelii Debx(Ranunculaceae)［J］.J Ethnopharmacology，2008，116(3):561－568.

［30］Chen M，Su M，Zhao L，et al.Metabonomic Study of Aristolochic Acid － Induced Nephrotoxicity in Rats［J］.Journal of Proteome Research，2006，5(4):995－1002.

［31］Chen C，Gonzalez F J，Idle J R.LC －MS－based Metabolomics in Drug Metabolism［J］.Drug Metab Rev，2007，39(2/3):581－597.

［32］Plumb R S，Stumpf C L，Granger J H，et al.Use of Liquid Chromatography/time－of－flight Mass Spectrometry and Multivariate Statistical Analysis Shows Promise for the Detection of Drug Metabolites in Biological Fluids［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2003，17(23):2632 –2638.

［33］Chen C，Ma X，Malfatti M A，et al.A Comprehensive Investigation of 2 －amino－1 － methyl－6 －phenylimidazo［4，5 － b］pyridine(PhIP)Metabolism in the Mouse Using a Multivariate Data Analysis Approach［J］.Chem Res Toxicol，2007，20(3):531 －542.

［34］Sun J，Von Tungeln L S，Hines W，et al.Identification of Metabolite Profiles of the Catechol－O－methyl Transferase Inhibitor Tolcapone in Rat Urine Using LC/MS－based Metabonomics A－nalysis［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2009，877(24):2557－2565.

［35］Courant F，Pinel G，Bichon E，et al.Development of a Metabolomic Approach Based on Liquid Chromatography－ High Resolution Mass Spectrometry to Screen for Clenbuterol Abuse in Calves［J］.Analyst，2009，134(8):1637 －1646.