低氧影響干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展*

劉曉奇， 閆景龍

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨四科，黑龍江哈爾濱150001)

氧穩(wěn)態(tài)是機(jī)體或細(xì)胞正常功能所必需的，低氧是人正常發(fā)育的一個(gè)重要的生理因素，并參與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展。在骨發(fā)育過(guò)程中，組織和細(xì)胞缺氧是經(jīng)常存在的。體內(nèi)生長(zhǎng)板軟骨增殖區(qū)氧濃度僅為2% －5%，肥大區(qū)氧濃度為 0.15% －1%[1]。機(jī)體損傷后，由于損傷部位血流中斷或血腫形成，造成局部氧分壓降低。在骨折血流中斷處，中央部位氧分壓甚至降低到0% －2%[2，3]。骨折修復(fù)需要機(jī)體在骨折部位重建血運(yùn)，以便吸收損傷組織和轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在機(jī)體代謝過(guò)程中，組織細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的維持由多種生理因素調(diào)控，其中低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor－1，HIF－1)是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的調(diào)控因子，在調(diào)控局部和系統(tǒng)低氧反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[4]。骨折之初，血管損傷，血供減少甚至中斷，導(dǎo)致骨折局部呈低氧狀態(tài)，處于骨折局部低氧環(huán)境中的細(xì)胞將有可能通過(guò)低氧 /HIF－1反應(yīng)通路而發(fā)生功能調(diào)整性變化，從而參與調(diào)節(jié)或影響骨折愈合的進(jìn)程[5]。

全身或局部的血供減少導(dǎo)致的氧含量下降，均會(huì)引起骨代謝的改變，導(dǎo)致骨量丟失?，F(xiàn)就近年來(lái)關(guān)于低氧對(duì)細(xì)胞分化及功能的影響做一下介紹。

1 低氧對(duì)細(xì)胞分化功能的影響

將間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)短暫暴露在低氧中對(duì)MSCs的生存并沒(méi)有產(chǎn)生明顯影響[7]。降低氧張力嚴(yán)重?fù)p害了人MSCs的脂肪化和成骨化分化能力。提升氧濃度從1%到3%則可恢復(fù)其成骨分化能力。同時(shí)，低氧能夠提升軟骨細(xì)胞分化和軟骨基質(zhì)合成;這種低氧誘導(dǎo)現(xiàn)象可能在軟骨細(xì)胞分化和軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中起到加強(qiáng)和保護(hù)軟骨表型和功能的作用[6]。蔣能剛等[7]研究指出在正常血清培養(yǎng)條件下，MSCs對(duì)低氧有較好的耐受性，48 h后低氧可顯著促進(jìn)干細(xì)胞增殖。金小嵐等[8]認(rèn)為低氧可以明顯抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化而促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。Salim等[9]也發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)MSCs成骨性分化幾乎沒(méi)有影響，相反，體外實(shí)驗(yàn)短時(shí)間低氧抑制了成骨細(xì)胞和間質(zhì)前體細(xì)胞骨小結(jié)形成和細(xì)胞外鈣沉淀。Gruber等[10]指出骨細(xì)胞在低氧條件下培養(yǎng)72 h，代謝活動(dòng)逐漸減少;低氧抑制細(xì)胞有絲分裂反應(yīng)與成骨性分化標(biāo)志物堿性磷酸酶和骨鈣素的表達(dá)。當(dāng)骨細(xì)胞再次在正常氧含量下培養(yǎng)7 d后，它們的反應(yīng)性恢復(fù)正常。這些發(fā)現(xiàn)表明低氧條件下成骨細(xì)胞可以短暫生存，但生長(zhǎng)分化能力降低。氧含量恢復(fù)后，它們?cè)鲋撤只芰謴?fù)正常，這也暗示復(fù)氧或血管形成是骨折愈合的關(guān)鍵一步。

2 低氧對(duì)干細(xì)胞成骨分化時(shí)相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

低氧可通過(guò)調(diào)節(jié)干細(xì)胞某些細(xì)胞因子的表達(dá)，影響細(xì)胞的功能。有研究認(rèn)為低氧降低了人成骨樣細(xì)胞Runx2/Cbfa1的表達(dá)－低氧96 h后，Runx2、I型膠原和堿性磷酸酶mRNA的表達(dá)都減少，并呈時(shí)間依賴(lài)性，堿性磷酸激酶的活性也以同樣的方式減少[11]。同時(shí)低氧也下調(diào)BMP－2和Runx－2表達(dá)，阻礙多潛能間質(zhì)前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞成骨性分化[9]。2007 年 Potier等[12]也證實(shí)將 MSCs短暫暴露在低氧中導(dǎo)致:(1)Cbfa1/Runx2、骨鈣素和Ⅰ型膠原持續(xù)下調(diào)(直到暴露后的14 d);(2)持久上調(diào)骨橋蛋白mRNA的表達(dá)(直至暴露后的28 d)。Nagano等[13]移植高醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的MSCs使骨產(chǎn)生早期的修復(fù)和骨質(zhì)替代，高ALDH的MSCs對(duì)低氧有更高的反應(yīng)性，上調(diào)Flt－1、CXCR－4和 angiopoietin－2的表達(dá)。Christopher等[14]也發(fā)現(xiàn)低氧壓抑CXCL－12的表達(dá)是細(xì)胞因子誘導(dǎo)成骨細(xì)胞移動(dòng)的關(guān)鍵一步。低氧可使循環(huán)骨髓衍生成骨前體細(xì)胞通過(guò)CXCR4/SDF－1途徑募集到骨修復(fù)部位[15]。骨樣細(xì)胞比成骨樣細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生更高的ORP－150，低氧培養(yǎng)提升礦化基質(zhì)的合成，堿性磷酸酶活性在早期低氧培養(yǎng)時(shí)增加，但在成骨時(shí)減少;低氧張力提升了成骨細(xì)胞分化和繼之的骨細(xì)胞形成[16]。并且低氧誘導(dǎo)最初的成骨細(xì)胞表達(dá)IGF －II而非 IGF －I[17]。Gross等[18]指出體內(nèi)急性失用和體外直接低氧可導(dǎo)致成骨細(xì)胞快速上調(diào)OPN表達(dá)。在OPN可促進(jìn)破骨細(xì)胞遷移和黏附的背景下，低氧誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞OPN表達(dá)可能調(diào)整失用誘導(dǎo)的骨吸收。低氧刺激可通過(guò)成骨細(xì)胞HIF－1α、ILK/Akt和mTOR途徑加強(qiáng)BMP－2 mRNA和蛋白水平[19]。

3 低氧預(yù)處理對(duì)干細(xì)胞活性的影響

干細(xì)胞成骨分化時(shí)的活性同樣受到氧張力的影響。Volkmer等[20]指出骨前體細(xì)胞如hMSCs定居在低氧環(huán)境中，而且，在體外3D培養(yǎng)條件下氧含量也較低。甚至移植入體內(nèi)后在血管還沒(méi)形成前也處于低氧狀態(tài)。他們首次指出在成骨誘導(dǎo)前低氧預(yù)處理hMSCs，保存了其在低氧條件下成骨性分化的潛能。低氧預(yù)處理增加人MSCs的能動(dòng)性和改進(jìn)了治療潛力。MSCs在低氧下培養(yǎng)增加了遷移率，并誘導(dǎo)表達(dá)cMet－肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的主要受體(體內(nèi)遷移和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的反應(yīng)性被認(rèn)為是MSCs募集和活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素)。在鼠缺血部位注射低氧預(yù)處理的MSCs后，血流的恢復(fù)明顯提前。他們的研究表明在植入前低氧預(yù)處理MSCs可以改進(jìn)組織再生潛能[21]。Kubo等[22]發(fā)現(xiàn)移植低氧預(yù)處理的細(xì)胞導(dǎo)致缺血組織血管化程度增加，并加強(qiáng)了干細(xì)胞治療的形態(tài)和功能上的益處。低氧預(yù)處理顯著增加了各種抗氧化和生存基因的表達(dá)。相比在氧含量正常條件下培養(yǎng)，低氧預(yù)處理的細(xì)胞可產(chǎn)生較低的氧應(yīng)激分子聚集且能使更多的細(xì)胞生存，經(jīng)28 d治療后，缺血肢體的血管密度和血流恢復(fù)明顯較好。Tang等[23]最近的研究指出CXC趨化因子SDF－1和CXC趨化因子受體4(CXCR4)的相互作用精密調(diào)節(jié)缺血導(dǎo)致低氧誘導(dǎo)的骨髓來(lái)源循環(huán)干細(xì)胞或前體細(xì)胞的募集。Oh等[24]報(bào)道低氧預(yù)處理可作為干細(xì)胞植入損傷組織抵抗缺血環(huán)境的新策略;這種策略改善了植入細(xì)胞和宿主細(xì)胞在損傷部位的生存力，他們認(rèn)為低氧預(yù)處理脂肪組織來(lái)源的間質(zhì)干細(xì)胞增加了細(xì)胞的生存能力和標(biāo)志基因表達(dá)。低氧可以提升人MSCs的增殖，加強(qiáng)集落形成能力，并阻止成骨細(xì)胞分化[25]。Ceradini等[26]證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá) SDF －1 指示組織缺血的存在，這種表達(dá)可以被低氧誘導(dǎo)因子1直接調(diào)節(jié)。有意思的是，骨髓環(huán)境中同時(shí)存在低氧和SDF－1，說(shuō)明低氧可能是自體干細(xì)胞運(yùn)輸和功能的必要條件。

綜上所述，干細(xì)胞對(duì)目標(biāo)組織微環(huán)境的耐受是其應(yīng)用過(guò)程中值得考慮的重要因素，體內(nèi)的氧張力明顯低于體外的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境。軟骨的整個(gè)代謝過(guò)程也是在一個(gè)低氧的環(huán)境下進(jìn)行;因此，在細(xì)胞治療中，MSCs必需克服低氧環(huán)境。研究表明，在MSCs治療中大部分干細(xì)胞不能適應(yīng)長(zhǎng)期的低氧環(huán)境而發(fā)生凋亡，從而影響治療效果。因而，研究低氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響，了解低氧條件下細(xì)胞增殖、分化的規(guī)律就顯得尤為重要。

盡管現(xiàn)在已經(jīng)對(duì)低氧影響干細(xì)胞的功能有了較多的認(rèn)識(shí)。但仍有許多問(wèn)題尚待解釋。如低氧條件下骨形成的調(diào)控機(jī)制?細(xì)胞因子在低氧條件下的表達(dá)及參與機(jī)制?長(zhǎng)期低氧對(duì)干細(xì)胞增殖和分化有怎樣的影響?這些都需要我們進(jìn)一步研究。

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