PI3K/Akt信號(hào)通路與肝纖維化

黃 成，李 俊，馬陶陶

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對(duì)各種慢性刺激進(jìn)行損傷修復(fù)反應(yīng)時(shí)，以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積的病理過(guò)程。關(guān)于HF機(jī)制及其防治的研究近年來(lái)己成為國(guó)內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)課題之一。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化形成過(guò)程中居核心地位，它激活、增殖，并合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)等多種物質(zhì)，使ECM合成與降解失衡，在肝臟內(nèi)過(guò)度沉積，肝臟結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肝纖維化［1］。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)家族，是一類(lèi)特異性地催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羥基磷酸化，并產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，可以募集和激活下游的靶物質(zhì)而啟動(dòng)一系列信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)。PI3K普遍存在于體內(nèi)各類(lèi)細(xì)胞，在細(xì)胞存活與分化、細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和凋亡等多種生理和病理過(guò)程中起重要作用［2］，參與自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［3－5］。大量文獻(xiàn)表明PI3K信號(hào)通路與肝纖維化的形成密切相關(guān)［6］，現(xiàn)就PI3K/Akt信號(hào)通路及其在肝纖維化中的作用作一綜述。

1 PI3K/Akt信號(hào)通路的組成

1.1 PI3K的組成PI3K是Whitman等［7］發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的脂類(lèi)第二信使，與v-src和v-ras等原癌基因的產(chǎn)物相關(guān)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成的異二聚體，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性。依結(jié)構(gòu)和底物的特異性不同，PI3K為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型;能被細(xì)胞表面受體激活的Ⅰ型PI3K研究最多;Ⅰ型PI3K依p110結(jié)合亞基的不同又分為IA和IB兩種亞型;IA型PI3K催化亞基p110包括p110α，p110β，p110δ;調(diào)節(jié)亞基主要有 p85α，p85β，p85γ;IB型PI3K催化亞基主要為 p110γ［8］;調(diào)節(jié)亞基包含:1個(gè)SH3區(qū)域、2個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域、2個(gè)被一非編碼區(qū)分開(kāi)的Src同源結(jié)構(gòu)域(Src homology domain 2，SH2)，該非編碼區(qū)為p85和p110相互作用的區(qū)域，2個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域可與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，引起催化亞基的膜轉(zhuǎn)位和活化，傳導(dǎo)酪氨酸激酶信號(hào)。Ⅰ型PI3K在體內(nèi)最常見(jiàn)底物為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸［PtdIns(4，5)P2，簡(jiǎn)稱(chēng) PIP2］［9］。

1.2 Akt的組成Akt(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)又稱(chēng)蛋白激酶B(PKB)，是原癌基因c-akt編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目前發(fā)現(xiàn)Akt有3種亞型:Akt1和Akt2在人體各組織中普遍表達(dá)，Akt3表達(dá)則有組織特異性［10］。3者受不同的基因編碼調(diào)節(jié)，蛋白結(jié)構(gòu)有將近80%的同源性，由位于氨基端的PH結(jié)構(gòu)域、中間催化域和羧基端的調(diào)節(jié)域結(jié)構(gòu)域組成。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用;中間催化域具有催化絲/蘇氨酸殘基磷酸化活性;羧基端的調(diào)節(jié)域含有磷酸化位點(diǎn)Ser473，該位點(diǎn)的磷酸化是Akt完全活化所必需的［11］。

2 PI3K/Akt信號(hào)通路的活化

PI3K/Akt通路的激活是一個(gè)多步驟的過(guò)程，包括兩種方式，一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活;另一種是通過(guò)Ras和p110直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K活化［12］。當(dāng)細(xì)胞外的配體與相應(yīng)的受體結(jié)合后，受體被激活發(fā)生同源或異源寡聚化或者RTK(receptor tyrosine kinase，受體酪氨酸激酶)自身磷酸化，為p85調(diào)節(jié)亞單位的SH2結(jié)構(gòu)域提供錨定位點(diǎn)，激活p85;改變p110和p85復(fù)合體的構(gòu)象，解除p85對(duì)p110激酶的抑制，活化p110，催化膜表面的 PIP2，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸［PtdIns(3，4，5)P3，簡(jiǎn)稱(chēng)PIP3］。PIP3作為第二信使與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，定位于PDK1(phosphoinositide dependen tkinase 1，磷酸肌醇依賴(lài)性激酶1)和PDK2附近。Akt的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露其磷酸化位點(diǎn)，PDK1磷酸化Akt的Thr308，PDK2磷酸化Ser473;活化的Akt脫離質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)和胞核，引起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖、分化、凋亡等重要的生物學(xué)事件［13］。

3 PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)

PI3K/Akt信號(hào)通路受到很多因素的影響。磷酸酯酶PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)通過(guò)使 PI(3，4，5)P3 在3羧基位脫磷酸生成PI(4，5)P2拮抗PI3K的活性。SHIP1/2(SH2 domain containing inositol 5`-phosphatase)基因，通過(guò)使PI(3，4，5)P3 在5 位去磷酸化，生成 PI(3，4)P2，減少 Akt的活化［14］。抑癌基因PHLPP1/2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)包括PHLPP1和 PHLPP2，可減弱Akt疏水基團(tuán)的磷酸化水平，抑制細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)化［15］。最近研究人員利用Akt羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域?yàn)樘结?，發(fā)現(xiàn)一種抑制Akt的磷酸化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子——羧基末端調(diào)節(jié)蛋白(CTMP)，可阻斷Akt下游信號(hào)的傳遞。

4 PI3K/Akt信號(hào)通路與肝纖維化關(guān)系

肝纖維化是慢性損傷導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過(guò)度沉積，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。在各種因素作用下，肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞自身可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子與活化產(chǎn)物等，這些因子可以通過(guò)各種信號(hào)通路調(diào)節(jié)HSC的功能，PI3K/Akt是其中重要的一條通路［16］。

4.1 PI3K/Akt信號(hào)通路和肝臟ECM的關(guān)系細(xì)胞外基質(zhì)特別是膠原的過(guò)度沉積，是肝纖維化形成的病理基礎(chǔ)。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在肝臟ECM產(chǎn)生和降解中起到重要作用。Reif等［17］應(yīng)用PDGF刺激HSC發(fā)現(xiàn)，Akt的磷酸化水平、α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均升高;其后應(yīng)用 PI3K抑制劑 LY294002或 Akt顯性失活突變體Ad5dnAkt發(fā)現(xiàn)，α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均明顯減少;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠pCol9GFP-HS4，5分離的HSC，應(yīng)用 LY294002可抑制報(bào)告基因的活性，表明PI3K在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)膠原蛋白的表達(dá)。而利用Ad-SMAdn-PI3K轉(zhuǎn)染活化的HSC，通過(guò)熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K活性能夠減少α1(Ⅰ)膠原的表達(dá)［18］。上述研究表明PI3K/Akt信號(hào)通路活性與膠原的生成具有明顯的相關(guān)性。

肝纖維化的產(chǎn)生是肝臟ECM的合成和降解失衡的過(guò)程，與肝臟ECM降解相關(guān)的主要是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)。MMP具有降解膠原等ECM的作用，而TIMP可抑制MMP的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路與MMP、TIMP的表達(dá)亦有關(guān)系。應(yīng)用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶作用于HSC，可使MMP-2與TIMP-2表達(dá)增高，利用PI3K抑制劑渥曼青霉素(wortmannin)或雷伯霉素(rapamycin，p70S6K抑制劑)則降低兩者的表達(dá)［19］。Li等［20］應(yīng)用leptin刺激HSC，發(fā)現(xiàn)TIMP-1表達(dá)增高與PI3K/Akt的活性有關(guān)。Lechuga等［21］也報(bào)道 LY294002能明顯抑制 TGFβ1對(duì)MMP-13的mRNA和蛋白誘導(dǎo)作用。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，活化PI3K/Akt在不同的細(xì)胞微環(huán)境中對(duì)MMP分泌的調(diào)節(jié)不同，對(duì)TIMP的調(diào)節(jié)則主要表現(xiàn)為增加分泌。由此給我們新的啟示:PI3K/Akt信號(hào)通路可影響MMP和TIMP的平衡，通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt信號(hào)通路恢復(fù)MMP和TIMP的平衡可成為抗肝纖維化的一個(gè)靶點(diǎn)。

4.2PI3K/Akt信號(hào)通路與HSC的關(guān)系肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，研究HSC增殖、凋亡的機(jī)制對(duì)了解肝纖維化的形成具有重要意義。近年來(lái)的多項(xiàng)研究表明，PI3K/Akt通路在HSC增殖、凋亡中扮演重要角色。Sancho-Bru等［22］將HSC與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Huh7細(xì)胞主要通過(guò)PI3K/Akt通路的活化促進(jìn)HSC的增值。利用Ad-SMAdnPI3K轉(zhuǎn)染HSC，培養(yǎng)72 h后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少;進(jìn)一步研究表明Ad-SMAdnPI3K轉(zhuǎn)染的HSC與對(duì)照組比較，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)明顯降低［18］。而利用高半胱氨酸(0.5 mmol·L－1)處理 HSC，48 h后采用［3H］-thymidine參入法檢測(cè)，DNA合成率可提高73%，7 d后檢測(cè)細(xì)胞數(shù)提高51%，應(yīng)用渥曼青霉素處理后，則明顯抑制HSC的增值［23］。TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一，因能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，受到廣泛的關(guān)注。利用TRAIL處理LX-2人肝星狀細(xì)胞系，可使細(xì)胞凋亡比率明顯增加，同時(shí)Akt磷酸化水平亦降低［24］。Panner等［25］在研究多形性惡性膠質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過(guò)活化mTOR(Mammalian target of rapamycin，一種與PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶)激活p70S6K(核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶，通過(guò)磷酸化S6K，增強(qiáng)mRNA的翻譯)，促進(jìn)FLIP(c-FLICE inhibitory protein)的蛋白表達(dá)，F(xiàn)LIP通過(guò)抑制caspase-8的活性，而抑制TRAIL引起的細(xì)胞凋亡。我們近期研究亦發(fā)現(xiàn)，肝纖維化形成過(guò)程中c-FLIPL表達(dá)明顯增加，通過(guò)siRNA干擾抑制c-FLIPL可明顯增加HSC對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控c-FLIPL的表達(dá);上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PI3K/Akt信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時(shí)，亦通過(guò)調(diào)控c-FLIPL抑制細(xì)胞凋亡。應(yīng)用促HSC凋亡的藥物聯(lián)合PI3K/Akt抑制劑，將有效的抑制HSC增殖，促進(jìn)HSC的凋亡，減少ECM的分泌，這給我們治療肝纖維化提供了新的思路。

4.3PI3K/Akt與致纖維化因子在肝纖維化病程中，一系列細(xì)胞因子通過(guò)旁分泌和自分泌方式作用于HSC，影響其活化、增殖與凋亡，調(diào)控著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展［26］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth facor beta，TGF-β)是刺激HSC分泌ECM作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一。TGF-β由Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和HSC等多種細(xì)胞所分泌，Smad信號(hào)蛋白通路是TGF-β經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［27］。利用 TGF-β1作用于 LY294002預(yù)處理后的人HSC，TGF-β1 依賴(lài)性的 ADAM12(融合素-α，參與肌母細(xì)胞融合和肌管形成)表達(dá)減少，p70S6K磷酸化水平亦明顯降低［28］。Neef等［29］，在應(yīng)用 BDL 和 TAA 建立大鼠肝纖維化模型過(guò)程中，分別與28 d，42 d后給予大鼠口服雷帕霉素(0.5 mg·kg－1·d－1)14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未用雷帕霉素相比，TAA組大鼠 TGF-β1 mRNA水平降低 50%，BDL組大鼠TGF-β2 mRNA水平亦降低50%。Runyan等［30］在研究TGF-β作用于腎小球系膜細(xì)胞時(shí)亦發(fā)現(xiàn)，LY294002或Akt顯性失活突變體可減少TGF-β誘導(dǎo)的α1(Ⅰ)、α2(Ⅰ)膠原的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)的PI3K/Akt活化可磷酸化Smad3的絲氨酸位點(diǎn)，從而增強(qiáng)Smad3的轉(zhuǎn)錄活性，來(lái)增強(qiáng)Ⅰ型膠原的表達(dá)。說(shuō)明PI3K/Akt的活化具有促進(jìn)TGF-β表達(dá)，增強(qiáng)其活性的功能。

血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)是強(qiáng)大的促細(xì)胞分裂劑，是體內(nèi)主要的促纖維化因子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種亞型，且在HSC均有表達(dá)［31］;PDGFβ受體表達(dá)增加是HSC活化的一個(gè)標(biāo)志，PDGFβ受體合成與PI3K/Akt通路有關(guān)，應(yīng)用PI3K通路抑制劑渥曼青霉素和LY294002可阻斷PDGFβ受體的表達(dá)［32］;Wang等［33］研究了索拉非尼(靶向抑制 PDGF 受體)抗纖維化作用，發(fā)現(xiàn)索拉非尼可通過(guò)抑制Akt、p70S6K磷酸化，抑制HSC的增殖，降低膠原的合成。Chen等［34］利用絞股藍(lán)總苷處理PDGF誘導(dǎo)的HSC，研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)總甙通過(guò)抑制PDGF-PI3K/Akt-p70 S6K信號(hào)途徑抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC增殖活化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PI3K/Akt信號(hào)通路在PDGF受體的表達(dá)，信號(hào)的傳導(dǎo)中具有重要作用。

胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factors，IGFs)是一類(lèi)重要的促細(xì)胞活化、分裂的生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)HSC增殖、分化等方面起了重要的作用。研究證實(shí)LY294002和雷帕霉素抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的鼠HSC中DNA合成;利用絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)抑制劑PD98059對(duì)IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的DNA合成抑制作用較弱;說(shuō)明PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)HSC的DNA合成中起著重要作用［35］。Gentilini等［36］利用渥曼青霉素和 LY294002抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的 HSC分化，影響其 DNA合成，揭示了IGF-Ⅰ能通過(guò)PI3K信號(hào)傳導(dǎo)途徑，影響HSC遷移及促有絲分裂，激活HSC的增殖。

瘦素(leptin)在肝纖維化形成過(guò)程中也發(fā)揮了重要的作用［37］。Aleffi等［38］應(yīng)用 leptin 處理人 HSC，結(jié)果表明 MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)，VEGF(vascular endothelial growth factor)，Ang-1(angiopoietin-1)等促炎癥反應(yīng)和促纖維化因子表達(dá)明顯增高，并增強(qiáng)PI3K/Akt通路的活性。我們前期應(yīng)用 leptin(75 μg·L－1)處理原代培養(yǎng)的大鼠HSC，Western blot和EMSA分析顯示Ⅰ型膠原明顯增高，采用［3H］-thymidine參入法研究了leptin對(duì)HSC增值效應(yīng)，結(jié)果顯示增值率達(dá)正常值的3倍，并明顯促進(jìn)Cyclin D1表達(dá);而應(yīng)用LY294002或A771726(來(lái)福米特活性代謝物)預(yù)培養(yǎng)后HSC增值效應(yīng)，Cyclin D1及Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯受到抑制［39］。PI3K/Akt對(duì)促肝纖維化因子的調(diào)控作用，顯示了PI3K/Akt通路在肝纖維化形成中的重要地位。

細(xì)胞信號(hào)通路是個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，PI3K/Akt信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間存在密切的聯(lián)系，對(duì)肝纖維化的形成也具有重要作用。如IGF-1和PDGF可同時(shí)增加HSC中PI3K和ERK通路的活性，而PI3K還參與ERK通路的激活。信號(hào)通路的協(xié)同作用對(duì)肝纖維化進(jìn)程中維持HSC的活化狀態(tài)具有重要作用。有報(bào)道［32］，在人HSC的培養(yǎng)中，應(yīng)用PI3K的抑制劑可使Ras/ERK通路的活性下降40% ～50%，表明PI3K參與Ras/ERK通路的活化。

5 展望

肝纖維化的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多條信號(hào)通路、多種細(xì)胞和細(xì)胞因子。PI3K/Akt信號(hào)通路從多個(gè)方面參與肝纖維化的形成。細(xì)胞因子間在體內(nèi)如何協(xié)調(diào)，各條通路間的相互作用及PI3K/Akt通路所起的作用還有待進(jìn)一步研究;不同因素造成的肝纖維化模型中及肝纖維化形成的不同階段，PI3K/Akt通路所起作用的差別也有待進(jìn)一步明確。抗肝纖維化藥物的研發(fā)是目前的熱點(diǎn)，PI3K/Akt通路是由多種物質(zhì)序貫而成，許多物質(zhì)與其他通路間又存在交叉聯(lián)系，因此在研究藥物對(duì)其作用時(shí)，既要把握重點(diǎn)，又要有整體觀念。

總之，PI3K/Akt信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，隨著對(duì)它認(rèn)識(shí)的逐步深入，對(duì)于闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，尋找治療肝纖維化的方法有著積極的意義。

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