布魯氏菌檢測技術(shù)的研究進展

許鄒亮 ，南文龍 ，陳義平

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷試劑研究室，山東青島 266032；2.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）侵入機體引起的人獸共患傳染病，我國將其列為二類傳染病[1]。布魯氏菌可感染包括人類在內(nèi)的多種家畜和野生動物，主要通過消化道、皮膚黏膜、呼吸道等途徑侵入機體，感染后引起相似的臨床癥狀，如長期發(fā)熱、流產(chǎn)與不育、虛弱、關(guān)節(jié)痛及肝脾腫大等。

目前，布魯氏菌屬已有10余個種的布魯氏菌存在[2]，不同種的布魯氏菌具有明顯的宿主危害傾向性，但大多具有不同宿主間的交叉感染能力，可引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。布魯氏菌病在我國廣泛存在，尤其在以畜牧業(yè)生產(chǎn)為主的地區(qū)。截至2009年，全國有29個省（區(qū)、市）發(fā)生畜間布魯氏菌病，牛、羊、豬感染達百萬頭之多，人的布魯氏菌病亦呈上升趨勢，2009年全年新增人布魯氏菌病3.7萬例[3]。世界范圍內(nèi)，每年出現(xiàn)約50萬例人布魯氏菌病[4]。

目前尚缺乏成熟的人用疫苗。人感染該病主要途徑為接觸感染動物。因此，加強對牛羊等易感動物的檢疫，淘汰感染病畜，消滅傳染源是防控布魯氏菌病切實可行的途徑。為防控該病，各國學(xué)者建立了多種布魯氏菌病診斷和檢測技術(shù)，主要包括細菌學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)方法等，本文即對相關(guān)檢測技術(shù)研究進展做一簡要綜述。

1 細菌學(xué)檢測方法

病原分離鑒定是診斷布魯氏菌病的傳統(tǒng)方法，被認(rèn)為是診斷該病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但布魯氏菌生長緩慢，所需營養(yǎng)復(fù)雜，而且必須保證一定量的活菌才能得到分離，同時，分離過程中存在生物安全問題，必須在P2級以上實驗室進行操作，具有潛在的危險性，所以在布魯氏菌病診斷及防制中難以推廣。

2 免疫學(xué)方法

2.1 傳統(tǒng)免疫學(xué)方法

傳統(tǒng)免疫學(xué)方法主要包括虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）、乳環(huán)試驗（MRT）、2-巰基乙醇試管凝集試驗（2-ME）和補體結(jié)合試驗（CFT）等幾種方法。RBT和SAT操作簡便，目前在國內(nèi)較為常用，適用于布魯氏菌病的基層檢測應(yīng)用；在國際貿(mào)易中，RBT也是牛、羊、豬布魯氏菌病的指定檢測方法。MRT是檢測牛、羊等動物奶樣的主要檢測方法[5]。CFT比RBT、SAT特異性強，也有標(biāo)準(zhǔn)化體系，但操作較為復(fù)雜。由于這些常規(guī)免疫學(xué)方法是基于抗體對抗原表面脂多糖O鏈的檢測，容易與如耶爾森氏菌O:9等細菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

運用ELISA檢測布魯氏菌抗體的研究報道較多，目前已有相關(guān)的商品化試劑盒，主要包括人布魯氏菌IgG抗體ELISA試劑盒、豬布魯氏菌抗體ELISA檢測試盒和犬布魯氏菌IgG抗體ELISA試劑盒等。Weynants等[6]以辣根過氧化物酶標(biāo)記的單抗12G12和羊種布魯氏菌疫苗株Rev.1的光滑型LPS建立了c-ELISA，并對936份血清樣本檢測，結(jié)果證明其特異性高于CFT和RBT。2004年，c-ELISA方法以其高特異性和敏感性的優(yōu)點被OIE列為診斷和清除牛布魯氏菌病的推薦方法。2006年，Gall等[7]建立了一種適用于現(xiàn)場診斷的FldELISA方法，該方法能在15分鐘內(nèi)檢測布魯氏菌抗體，敏感性和特異性分別為100%和94.2%。2009年，Chaudhuri等[8]用omp28重組外膜蛋白抗原建立的iELISA方法，對382份牛血清進行檢測并與RBT試驗比對，結(jié)果敏感性為88.7%，特異性為93.8%。

2.3 熒光偏振試驗（FPA）

FPA是利用抗原/抗體相互作用的一種快速檢測技術(shù)，操作簡單，但需要專門的儀器設(shè)備。診斷布魯氏菌病時，可將牛種布魯氏菌光滑型LPS的小分子量片段OPS標(biāo)記上FITC作為抗原，用此抗原加到稀釋的血清或全血中，抗體含量可在2分鐘（血清）或15分鐘（全血）內(nèi)用熒光偏振試驗分析測定出來。FPA診斷牛種布魯氏菌的特異性和敏感性幾乎與c-ELISA相同。Lucero等[9]用FPA方法對84份懷疑感染布魯氏菌的病人血清檢測，其中15例FPA和c-ELISA都能檢出，3例只有c-ELISA檢出，4例只有FPA檢出。Gall等[10]用FPA檢測牛種布魯氏菌，并與其它血清學(xué)檢測方法進行比較，認(rèn)為FPA是檢測牛布魯氏菌最穩(wěn)定的血清學(xué)方法之一，其敏感度和特異性分別是96.3%和97.6%；通過雙盲實驗證實熒光偏振法還可以區(qū)別牛種布魯氏菌感染和疫苗株S19免疫接種。Schumaker等[11]用FPA方法對自然環(huán)境中野牛的布魯氏菌病感染情況進行血清學(xué)調(diào)查，F(xiàn)PA顯示出很高的敏感性。

2.4 免疫膠體金層析法（GICA）

Henk等[12]在2003年建立了兩種免疫膠體金層析法，一種用于檢測布魯氏菌特異性的IgM，另一種用于檢測IgG。這兩種方法能夠檢測急性、持續(xù)性和反復(fù)發(fā)作性感染，可用于指導(dǎo)病人的治療。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 PCR及Real-time PCR

1992年，Herman等[13]將牛種布魯氏菌和根瘤土壤桿菌序列比對后，選擇保守性較強的16 S rRNA作為擴增片段，能夠特異、敏感、快速地檢測布魯氏菌。Leal-Klevezas等[14]利用PCR技術(shù)診斷山羊布魯氏菌病，并與常規(guī)的血清學(xué)和細菌學(xué)方法進行比較，在對300份臨床樣品的檢測中，針對血液樣本，PCR方法的陽性檢出率為86%，而血清學(xué)方法的陽性檢出率為60%，只從一份血培養(yǎng)中分離到細菌；針對奶樣，PCR方法陽性檢出率為64%，但是培養(yǎng)時卻沒有分離到細菌。Gupta等[15]利用omp31基因設(shè)計引物建立PCR方法，用于山羊布魯氏菌病的檢測，在對54份有流產(chǎn)史的山羊奶樣檢測中，血清學(xué)方法陽性檢出率為59%，而PCR為88.8%，對照試驗中PCR的靈敏性和特異性分別為90%和100%。2005年，Elfaki等[16]建立了基于31KD布魯氏菌抗原基因序列的PCR檢測方法，結(jié)果能從待檢血清中擴增出223 bp大小的目的片段，陽性檢出率達96%，試驗證明血清是一種適用于PCR診斷布魯氏菌病的樣本。

2005年，Debeaumont等[17]建立了用于檢測人血清樣本中布魯氏菌的Real-time PCR方法，特異性和敏感性均優(yōu)于細菌分離和血清學(xué)方法。2009年，Vladimira等[18]基于IS711基因建立了Real-time PCR方法用于檢測野豬血液樣本中的布魯氏菌，并與細菌分離和血清學(xué)方法進行比較，結(jié)果顯示IS711 real-time PCR方法從血清陰性的樣本中檢出11.1%（16/144）的陽性。2010年，孟茹等[19]利用二重Real-time PCR技術(shù)建立了鑒別診斷布魯氏菌和結(jié)核桿菌的方法，對24份結(jié)核痰樣、11份布魯氏菌基因粗提物及30份模擬奶樣進行檢測，符合率為100%。

3.2 核酸探針檢測

核酸探針是指帶有標(biāo)記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，可用于待測核酸樣品中特定基因序列的檢測。1996年，Matar等[20]用PCR從BCSP31基因序列上擴增出223bp的目的片段，然后用25 bp地高辛標(biāo)記的探針對該序列進行雜交，結(jié)果顯示出良好的特異性。同年，王希良等[21]用牛種布魯氏菌構(gòu)建PBC4重組質(zhì)粒，經(jīng)Kpnl和BamHI雙酶切回收224 bp的DNA片段，將此片段純化后采用地高辛標(biāo)記方法制備探針。點雜交結(jié)果表明，此探針檢測布魯氏菌DNA的靈敏度達5 pg，對中國19個布魯氏菌分離株DNA雜交出現(xiàn)強的雜交信號而對其它5種革蘭氏陰性菌DNA以及人白細胞DNA沒有產(chǎn)生雜交反應(yīng)。2000年，F(xiàn)ernandez-Lago等[22]以牛種布魯氏菌16 S rRNA序列制備熒光寡核苷酸探針進行全菌雜交試驗，利用B6、B9和B13三種熒光探針鑒定出了所有種型的代表菌株以及9株不同的臨床分離株，其中B9探針可以將豬種布魯氏菌2、3、4、5型與其它種型布魯氏菌鑒別。

3.3 PCR-ELISA技術(shù)

PCR-ELISA技術(shù)結(jié)合了PCR的敏感性、探針的特異性等優(yōu)點，具有級聯(lián)放大的效果。2003年，Morata等[23]建立了一種檢測布魯氏菌病的PCR-ELISA方法，結(jié)果能從3.5μg人基因組DNA的背景中檢測到10 fg的細菌DNA，相當(dāng)于2個細菌。通過對布魯氏菌病患者的59份外周血液樣本及113份對照樣本進行檢測，敏感性和特異性分別為94.9%和96.5%，而血液培養(yǎng)的敏感性只達到70.1%。2004年，Alahouk等[24]建立了一種新型PCR-ELISA體系，可用于臨床樣品的高通量檢測。

綜上所述，各種檢測技術(shù)各有所長，細菌分離仍是布魯氏菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，在我國，大規(guī)模的布魯氏菌病普查仍以傳統(tǒng)的血清學(xué)方法為主，而以ELISA為代表的免疫學(xué)方法和以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法以其敏感性高和特異強的特點將具有良好的應(yīng)用前景。

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