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    細胞膜穿透肽在腫瘤治療中的應(yīng)用策略

    2011-02-11 00:22:36徐雅君曾慶友許瑞安
    中國醫(yī)藥指南 2011年13期
    關(guān)鍵詞:跨膜溶酶體細胞膜

    徐雅君 曾慶友,2* 許瑞安*

    (1 教育部分子藥物工程研究中心、華僑大學分子藥物學研究所,福建 泉州 362021;2 華僑大學化工學院,福建 泉州 362021)

    細胞膜穿透肽(cell penetrating peptide,CPPs)是一些具有細胞穿透功能的短肽的統(tǒng)稱,一般少于30個氨基酸,其中堿性氨基酸占多數(shù)[1]。此外,CPPs還能幫助生物大分子穿過血腦屏障且無毒副作用[2,3]。CPP的這些特性使其成為一種有效的運輸載體,向細胞內(nèi)運送各種自身不能穿越細胞膜的大分子生物活性物質(zhì),為生物治療提供了一個嶄新的有力工具。到目前為止,已有CPPs作為載體成功的將多肽、蛋白質(zhì)、DNA及siRNA等導入細胞內(nèi)的報道[4-7]。但是隨著研究的深入,我們發(fā)現(xiàn)CPPs作為載體,存在與血液的不相容性,缺少組織特異性,易被內(nèi)體捕獲從而進入溶酶體被降解等問題[8,9],從而大大的降低了CPPs的轉(zhuǎn)染率,限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用。因此,有效解決上述問題是優(yōu)化CPPs在腫瘤治療中的作用的關(guān)鍵。

    1 優(yōu)化CPP的體內(nèi)相容性

    CPP本身具有生物組織相容性且無毒副作用。但是,在體內(nèi)給藥時,由于CPP中堿性氨基酸占多數(shù),所以,其在生理pH 7.4條件下帶正電荷,易與血液發(fā)生作用,引起血栓,從而對人體造成傷害,甚至引發(fā)死亡[10,11]。因此,在用CPP作載體,進行體內(nèi)給藥時,我們要首先對CPP進行修飾來掩蓋其表面的正電荷。載體表面修飾,最常用的方法是聚乙二醇化,聚乙二醇不僅具有很好的生物相容性,還可以增強載體在體內(nèi)的穩(wěn)定性并延長其體內(nèi)循環(huán)時間,從而提高藥效。Morris等[12]將細胞膜穿透肽Pep-3聚乙二醇化,并證實了修飾后的Pep-3在體內(nèi)的穩(wěn)定性較未修飾的大大的提高了。Van Dongen等[13]也將細胞膜穿透肽Tat和聚乙二醇化聯(lián)合起來使用,來提高酶載納米反應(yīng)器的轉(zhuǎn)染率。

    CPP本身是沒有組織特異性的,所以在進行體內(nèi)給藥時,CPP會帶著負載的藥物會進入所有組織,這樣就會使到達靶組織的藥物濃度減少[8,14,15]。此外,抗腫瘤藥物一般上對正常組織會有傷害作用,所以,在治療腫瘤的時候我們要盡量使抗腫瘤藥物具有靶向性,能直達腫瘤組織起作用。理論上來說,解決CPP的腫瘤靶向性的問題并不難,但實際上,解決這個問題是一難點。因為在組織中,CPP和接上的配體的作用是相互抑制的。Anderson等[16]將Fab片段與Tat相連,并證實Fab連接后的Tat確實具有細胞靶向性,但是這個研究同時也指出Fab抑制Tat的穿膜能力,而Tat也抑制Fab尋找靶細胞的能力,二者之間存在矛盾。如何解決CPP與配體之間的矛盾呢?首先,我們要考慮到二者的發(fā)揮作用的空間的差異,配體是在組織外作用,以達到尋找靶組織的目的;CPP是在細胞膜上起作用,以達到跨膜的目的。其次,我們要考慮到正常組織與靶組織之間的生理差異,如pH的不同,腫瘤特異的酶。最后,我們就可以根據(jù)上述兩方面得到一種可行的策略,對CPP進行修飾改造。Jiang等[17]用陰離子多肽將聚精氨酸多肽掩蓋,從而使聚精氨酸不能發(fā)揮作用,進入細胞;直到到了腫瘤組織,由于腫瘤組織特異性酶MMP2的存在,切斷了陰離子多肽與聚精氨酸之間的連接,聚精氨酸暴露發(fā)揮作用,從而進入腫瘤細胞。

    因此,CPP作為載體應(yīng)用于體內(nèi)治療時,應(yīng)考慮先將CPP掩蓋,直至到達靶組織時,再將其釋放。這樣才能使CPP的作用得到很好的發(fā)揮,而且將對機體組織的傷害降到了最低。

    2 精確CPP的跨膜過程

    CPP最初被認為是以非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的方式進入細胞的[18,19]。但從2003年后,人們逐漸發(fā)現(xiàn)了細胞內(nèi)吞作用在CPP應(yīng)用試驗中的存在,并且最終確認內(nèi)吞作用是CPP介導藥物進入細胞的主要方式,而直接穿膜作用也是進入細胞的方式之一[20,21]。因此,CPP介導的跨膜作用包括很多途徑,而途徑的選擇不僅與CPP種類及負載藥物的性質(zhì)有關(guān),而且與靶細胞的種類有關(guān)[22-24]。此外,又由于至今為止CPP的跨膜機制還不明確,所以,對于目前的狀況來說,在細胞實驗前確定某一具體的CPP及其負載物進入細胞的途徑幾乎是不可能的,而這種不確定又在很大程度上增加了時間的耗費和成本。解決這個問題的關(guān)鍵就是要明確CPP的跨膜機制。

    目前已提出了很多CPP的跨膜機制,主要包括3類。第一種是通過靜電作用直接滲透通過細胞膜。具體過程為未折疊的CPP融合蛋白首先與細胞膜表面通過靜電方式結(jié)合,然后直接跨過細胞膜,接著在分子伴侶的幫助下發(fā)生重折疊[25,26]。這是針對早期研究發(fā)現(xiàn)的認為CPP是非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的非經(jīng)典內(nèi)吞方式的跨膜機制。第二種跨膜機制是通過形成某種跨膜結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)導進入細胞。這類機制包括3種可能的模式[27]:反轉(zhuǎn)微團模式、地毯模式和打孔模式。第三種跨膜機制是內(nèi)吞作用介導入膜,這類機制是在發(fā)現(xiàn)CPP跨膜過程中涉及內(nèi)吞作用后提出的[28-30]。

    雖然現(xiàn)在CPP的跨膜機制還不明確,但是其穿膜特性是肯定的。此外,人們還開始認識到CPP的一次跨膜并不僅僅涉及一種跨膜機制[31]。有很多機制參與CPP的一次跨膜,重要的是哪種機制為主。因此,目前的重點是明確跨膜機制,然后根據(jù)其來改造CPP,使其主要按人們想要的那種機制跨膜。

    3 促進CPP 從內(nèi)體逃逸

    雖然CPP的一次跨膜涉及很多機制,但是人們發(fā)現(xiàn)至今為止應(yīng)用的CPP負載藥物跨膜都以內(nèi)吞作用跨膜為主,而又由于內(nèi)吞作用跨膜時存在內(nèi)體捕獲和溶酶體降解的問題,所以,我們就要考慮如何幫助CPP及其負載物從內(nèi)體逃脫,以防止其進入溶酶體,從而在溶酶體堆積或被降解[32,33]。

    促進CPP從內(nèi)體逃逸的方法主要有5種:①化學物質(zhì)輔助逃逸,如氯喹、Ca2+等。Wattiaux等[34]用熒光標記Tat,并在細胞培養(yǎng)基中加入氯喹,幾小時后在細胞質(zhì)和細胞核中發(fā)現(xiàn)了熒光,首次證實了氯喹可以促進CPP從內(nèi)體逃脫進入胞質(zhì),進入細胞核。Shiraishi等[35]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入Ca2+能促進CPP偶聯(lián)的PNA從內(nèi)體釋放。雖然Ca2+能明顯促進CPP從內(nèi)體逃脫,但其作用機制仍不清楚。②光敏物質(zhì)輔助逃逸。光敏物質(zhì)能在可見光的激發(fā)下產(chǎn)生活性氧簇,而活性氧簇能破壞內(nèi)體膜,促進內(nèi)體內(nèi)物質(zhì)釋放進入胞質(zhì)。因此,應(yīng)用CPP作為載體運送生物活性物質(zhì)進入細胞內(nèi)的同時給予光敏物質(zhì)可促進內(nèi)含體內(nèi)含物的釋放。Endoh等[36]將siRNA連接到CPP上,在激光的照射下,CPP成功將siRNA導入到CHO細胞,誘導U1A基因的沉默。③天然或合成的聚合物輔助逃逸,例如蜂毒肽及人工合成的短肽如43E(LAEL-LAELLAEL)。Ogris等[37]將蜂毒肽結(jié)合到聚乙烯亞胺PEI上,形成MELPEI-DNA復合物,發(fā)現(xiàn)蜂毒肽能促進DNA從內(nèi)體釋放到胞質(zhì),并引導其跨過核膜屏障進入細胞核。④病毒微生物輔逃逸,例如流感病毒血凝素2蛋白(HA2)。一些病毒微生物在進化過程中獲得了從內(nèi)體逃逸的本領(lǐng),而這種逃逸與微生物自身元件在低pH值環(huán)境中,破壞內(nèi)含體溶酶體膜有關(guān)[38]。Sugita等[39]用熒光素標記TAT,分別處理細胞,發(fā)現(xiàn)TAT單獨處理時熒光只是集中在內(nèi)體,而與TAT-HA2共處理后則發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)中有大面積熒光。⑤ CPP自身改造促進逃逸[40,41]。雖然上述5種方法能促進CPPs及其負載物從內(nèi)體逃逸,但卻存在操作繁瑣、運送載體構(gòu)造復雜及毒副作用較大等缺點。因此,人們開始尋找更簡便、更安全的方法來促進CPP的內(nèi)體逃逸,對現(xiàn)有CPPs進行改造是最可行的方法。目前已提出很多關(guān)于CPP改造的方案,也已對很多方案進行試驗驗證,雖然有所進展,但仍缺少實質(zhì)性的突破。

    5 結(jié)語與展望

    細胞膜穿透肽可以有效地將多肽、蛋白質(zhì)及DNA片段等生物大分子導入多種哺乳動物細胞,且在一定濃度范圍內(nèi)不會造成細胞損傷。目前,雖然CPP在應(yīng)用過程中存在很多的問題,甚至CPP的跨膜機制也不明確,這是造成很多問題的關(guān)鍵。但是仍可以肯定CPP是生物活性分子有效的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運工具,而且我們有理由相信,經(jīng)過改造的CPP,未來的CPP將作為高效的生物藥物輸送載體,在疾病的預(yù)防、檢測及治療中發(fā)揮重要的作用[42]。

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