敬釗毒素-XI與突變體R3A-JZTX-XI的合成、復(fù)性及其藥理活性鑒定

池宇朋，鄧梅春，吳遠(yuǎn)遠(yuǎn)，羅吉，容明強(qiáng)，張亦雅，張東裔，曾雄智，梁宋平

1 湖南師范大學(xué) 蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410081

2 國(guó)防科學(xué)技術(shù)大學(xué)理學(xué)院 化學(xué)與生物學(xué)系生物信息研究中心，長(zhǎng)沙 410073

延遲整流鉀通道主要負(fù)責(zé)動(dòng)作電位復(fù)極化，其中該通道 Kv2.1亞型被發(fā)現(xiàn)在人等幾類物種的β-胰島細(xì)胞上廣泛存在，有研究報(bào)道顯示 Kv2.1通道在調(diào)節(jié)β-胰島細(xì)胞的胰島素分泌上發(fā)揮重要的作用[1-4]。河豚毒素不敏感型鈉通道 Nav1.5亞型是心肌的主要鈉通道并在心肌電活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，許多心臟疾病如長(zhǎng) QT綜合癥、心肌傳導(dǎo)功能障礙等已經(jīng)被證明是 Nav1.5基因突變所致[5]。敬釗毒素-XI (Jingzhaotoxin-XI，JZTX-XI) 是從我國(guó)境內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的珍稀蜘蛛敬釗纓毛蛛 Chilobrachys jingzhao[6]粗毒中純化得到的一種新型肽類神經(jīng)毒素。該毒素由34個(gè)氨基酸殘基組成，分子中6個(gè)半胱氨酸形成 3對(duì)二硫鍵。前期的研究結(jié)果顯示JZTX-XI對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上表達(dá)的電壓門控鈉通道和鈣通道均沒(méi)有影響，卻對(duì)非洲爪蟾卵母細(xì)胞上表達(dá)的 Kv2.1鉀通道電流和急性分離的大鼠心肌細(xì)胞鈉通道電流具有抑制作用，并采用二維核磁共振技術(shù)解析了JZTX-XI的三維溶液結(jié)構(gòu)，根據(jù)該毒素的結(jié)構(gòu)信息推測(cè)JZTX-XI的N端第3位的精氨酸殘基可能是負(fù)責(zé) JZTX-XI與 Kv2.1通道及Nav1.5通道相互結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基[7]。我們正在研究通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)力爭(zhēng)消除 JZTX-XI對(duì)Nav1.5通道的抑制活性，從而正在把JZTX-XI改造成為一個(gè)高效特異性的 Kv2.1通道亞型抑制劑，實(shí)現(xiàn)將該毒素開(kāi)發(fā)成治療2型糖尿病藥物的潛在醫(yī)用價(jià)值。為了深入研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，本文用固相多肽合成的方法合成了天然JZTX-XI及其突變體R3A-JZTX-XI，并探索合成產(chǎn)物的氧化復(fù)性條件，結(jié)合電生理膜片鉗技術(shù)研究合成毒素對(duì) HEK293T細(xì)胞上瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)的鉀通道亞型 Kv2.1和鈉通道亞型Nav1.5電流的抑制作用，為下一步通過(guò)蛋白質(zhì)工程將JZTX-XI改造成一個(gè)高效特異性的Kv2.1通道亞型或Nav1.5通道亞型的抑制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

9-芴甲氧羰基 (Fmoc) 氨基酸、N-甲基嗎啡啉(NMM)、哌啶 (Piperidine) 購(gòu)自吉爾生化 (上海) 有限公司；Rink Resin樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)和成公司；還原型谷胱甘肽 (GSH)、氧化型谷胱甘肽 (GSSG)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽 (Tris-HCL)、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2’-乙磺酸 (HEPES)、乙二醇雙 (2-氨基乙基) 四乙酸(EGTA)、N-甲基-D-葡萄糖胺 (NMG)、二巰基乙烷、苯甲硫醚、三氟乙酸 (TFA)、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CCA) 等購(gòu)自Sigma公司；二甲基甲酰氨 (DMF) 購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；3-四甲基脲六氟磷酸酯 (HCTU) 購(gòu)自上海正極生物科技有限公司；乙腈、甲醇均購(gòu)自湖南化工研究院。HEK293T細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究生院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，SCN5A-pCDNA3.1[8]和hK2.1[9]通道質(zhì)粒分別由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)Robert S. Kass教授和英國(guó)倫敦大學(xué)藥學(xué)院的Martin Stocker教授提供。

1.2 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的化學(xué)合成與分離純化

采用Fmoc-氨基酸和HCTU偶聯(lián)的固相多肽化學(xué)合成方法[10]，在PS3 多肽合成儀上進(jìn)行多肽的固相化學(xué)合成。多肽粗品利用半制備型的反相 HPLC進(jìn)行分離純化 (反相柱：10 mm×250 mm Phenomenex C18 column；洗脫液A：含0.1% TFA的水溶液；洗脫液B：含0.1% TFA 的乙腈，洗脫梯度為20 min內(nèi)B液的濃度變化為25%~35%；流速是3.0 mL/min)，利用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析各峰的質(zhì)荷比，以確定目的峰的位置，然后收集目的峰真空冷凍干燥。再選取目的峰再用分析型的反相HPLC (Waters Alliance) 進(jìn)行分離純化 (反相柱：Waters 4.6 mm×250 mm C18 column；洗脫梯度同上，流速為1.0 mL/min)，通過(guò)上述2次分離純化確保合成產(chǎn)品純度達(dá)到95%以上，然后凍干備用。

1.3 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的氧化還原復(fù)性

參照文獻(xiàn)[10]的方法，每次各取0.1 mg純化的合成的JZTX-XI粗樣在1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl、一定比例濃度的 GSH/GSSG、不同pH值的緩沖液中進(jìn)行氧化復(fù)性。對(duì)于每個(gè)復(fù)性條件都在不同的時(shí)間間隔取出100 μL反應(yīng)液，加10 μL 50% TFA水溶液終止反應(yīng)后，用分析型反相HPLC進(jìn)行氧化復(fù)性的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) (反相柱：Waters 4.6 mm×250 mm C18 column，洗脫液A：含0.1% TFA 的水溶液；洗脫液B：含0.1% TFA的乙腈，洗脫梯度為20 min內(nèi)B液的濃度變化為25%~35%，流速為1.0 mL/min)，對(duì)收集洗脫峰進(jìn)行質(zhì)譜分析來(lái)確定合適的復(fù)性時(shí)間和pH值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再采用最優(yōu)條件對(duì)天然毒素和突變體R3A-JZTX-XI進(jìn)行氧化復(fù)性。

1.4 氧化復(fù)性產(chǎn)物與天然JZTX-XI共洗脫實(shí)驗(yàn)

將氧化復(fù)性JZTX-XI與天然JZTX-XI等量混合后，在反相HPLC (Waters Alliance) 上進(jìn)行共洗脫實(shí)驗(yàn) (色譜條件同1.3)。

1.5 人胚腎細(xì)胞 (Human embryonic kidney 293T，HEK293T) 的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)按照標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)條件 (37 ℃、5% CO2、15%的相對(duì)濕度)，在培養(yǎng)箱中用含 10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。Nav1.5和K2.1通道質(zhì)粒與HEK293T細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是采用美國(guó)Invitrogen公司的脂質(zhì)體2000按照用戶使用手冊(cè)進(jìn)行。先將Nav1.5或K2.1通道質(zhì)粒與脂質(zhì)體2000和綠色熒光蛋白GFP報(bào)告質(zhì)粒復(fù)合物滴加進(jìn)入盛有HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕輕混勻后孵育4~6 h，再換新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后24~72 h內(nèi)均可挑選顯示綠色熒光的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)[11]。

1.6 瞬時(shí)表達(dá)于 HEK293T細(xì)胞的 hKv2.1和hNav1.5通道電流的記錄

室溫 (25±1) ℃下采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電流記錄利用 EPC9放大器 (HEKA公司，German) 在電腦上進(jìn)行，記錄和分析系統(tǒng)采用Pulse+Pulsefit 8.0軟件。玻璃管為 100 μL (VWR micropipettes，VWR Company) 的硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管。玻璃電極經(jīng)兩步拉制而成，充灌電極液后電極電阻一般為 2~3 M?。測(cè)定鈉電流的細(xì)胞外液為(mmol/L)：NaCl 140、KCl 3、MgCl21、CaCl21和HEPES 10，調(diào)pH值為7.3；細(xì)胞內(nèi)液為 (mmol/L)：CsF 140、EGTA 1、NaCl 10和HEPES 10，pH 7.3。測(cè)定鉀通道電流的細(xì)胞外液為 (mmol/L)：Choline chloride 130、D-glucose 12、MgCl22、CaCl22和HEPES 10，pH 7.2。細(xì)胞內(nèi)液為 (mmol/L)：KF 120、NMG 20、HEPES 10、EGTA 10、MgATP 2和Li2GTP 0.5，pH 7.2。細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)液均用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 JZTX-XI與R3A-JZTX-XI的固相化學(xué)合成

合成的 JZTX-XI粗品經(jīng)真空冷凍干燥后為白色粉末，采用RP-HPLC分離純化2次，收集洗脫峰經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，其中保留時(shí)間為15.1 min的單一峰相對(duì)分子量 (MH+) 為3 734.041 (圖1A)，與JZTX-XI (線性) 理論分子量3 733.358相符；保留時(shí)間為 17.0 min的單一峰相對(duì)分子量(MH+) 為3 649.012 (圖1B)，與R3A-JZTX-XI (線性) 理論分子量3 648.250相符，提示固相多肽合成是成功的。

圖1 JZTX-XI和R3A-JZTX-XI的合成RP-HPLC分析圖Fig. 1 Identification of synthetic JZTX-XI and R3A-JZTX-XI by RP-HPLC. (A) JZTX-XI. (B) R3A-JZTX-XI. The synthetic JZTX-XI and R3A-JZTX-XI were applied to a phenonmenex C18 column (10 mm×250 mm) pre-equilibrated with 0.1% TFA. Elution was performed with a linear gradient of 25%?35% acetonitrile over 20 min at a flow rate 3.0 mL/min at 40 °C. Asterisks indicated the fractions of interest.

2.2 JZTX-XI及R3A-JZTX-XI的氧化還原復(fù)性

化學(xué)合成的多肽由于是線性分子，沒(méi)有生物學(xué)活性，所以檢測(cè)活性前需要進(jìn)行氧化復(fù)性，使其形成正確的空間結(jié)構(gòu)和二硫鍵配對(duì)，但氧化還原復(fù)性的過(guò)程常受多種因素的影響。因此在大量合成多肽進(jìn)行復(fù)性前，需要探索其最佳氧化復(fù)性條件。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室以往的復(fù)性研究結(jié)果，確定樣品濃度為0.05 g/L較好，然后比較采用不同比例濃度的谷胱甘肽組合GSH/GSSG (5 mmol/L∶0.5 mmol/L，2 mmol/L∶0.2 mmol/L，1.0 mmol/L∶0.1 mmol/L)和不同pH值 (7.0、7.5、8.0) 緩沖溶液條件下復(fù)性產(chǎn)物峰面積的大小，從而確認(rèn)JZTX-XI的最佳氧化復(fù)性條件為：含 1.0 mmol/L GSH、0.1 mmol/L GSSG、pH為8.0、濃度為0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液，樣品質(zhì)量濃度為0.05 g/L，復(fù)性溫度為4 ℃。圖 2A展示了線性 JZTX-XI氧化復(fù)性動(dòng)態(tài)變化情況。隨著復(fù)性時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)性目的峰形逐漸變大，峰面積逐漸增加。當(dāng)復(fù)性進(jìn)行至12 h以后，峰形在48 h之內(nèi)都能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，單一主峰明顯，提示該毒素分子的復(fù)性在12 h內(nèi)已經(jīng)基本完成。復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，相對(duì)分子質(zhì)量為3 726.115 (圖3A)，比線性JZTX-XI的分子質(zhì)量減少了6，提示復(fù)性后的JZTX-XI形成了3對(duì)二硫鍵。將復(fù)性產(chǎn)物與天然JZTX-XI等量混合后進(jìn)行共洗脫實(shí)驗(yàn)只得到單一峰 (圖2B)，推斷復(fù)性產(chǎn)物的二硫鍵配對(duì)方式正確，合成毒素與天然毒素在結(jié)構(gòu)上具有一致性。突變體R3A-JZTX-XI的合成、分離和復(fù)性方法均同上。復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定，其相對(duì)分子質(zhì)量為3 642.617 (圖3B)，形成了3對(duì)二硫鍵，與預(yù)期一致。

圖2 JZTX-XI的反相色譜圖Fig. 2 RP-HPLC chromatograms of sJZTX-XI. (A) HPLC chromatograms in refolding process of synthetic JZTX-XI. (B) HPLC chromatogram of co-injected native and refolded JZTX-XI in refolding process.

圖3 sJZTX-XI和R3A-JZTX-XI復(fù)性產(chǎn)物的質(zhì)譜圖譜Fig. 3 Mass spectra of refolded sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI. (A) sJZTX-XI. (B) R3A-JZTX-XI.

2.3 JZTX-XI和 R3A-JZTX-XI對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞的hNav1.5鈉通道活性的影響

前期的研究顯示JZTX-XI可以抑制大鼠心肌細(xì)胞上的鈉通道電流，其Kd為0.74 μmol/L[7]。然而，JZTX-XI對(duì)電壓門控鈉通道亞型的作用卻還不清楚。本文運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了JZTX-XI對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞的鈉通道亞型hNav1.5的影響。電流去極化誘導(dǎo)方式：細(xì)胞膜電位鉗制?80 mV，以50 ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓?10 mV，每隔 5 s重復(fù) 1次。膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)表明，1.0 μmol/L的天然 JZTX-XI (nJZTX-XI) 和合成JZTX-XI (sJZTX-XI) 分別能抑制 (70.4±3.1)% (圖4A，n=5) 與 (67.5±4.2)% (圖4B，n=5) 的hNav1.5通道電流，表明合成 JZTX-XI與天然 JZTX-XI對(duì)hNav1.5通道電流的抑制作用的大小非常接近，進(jìn)一步證實(shí)合成JZTX-XI與天然JZTX-XI在結(jié)構(gòu)與活性性上具有一致性。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明合成JZTX-XI對(duì) hNav1.5通道的抑制作用具有明顯的濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度 (IC50) 為437.12 nmol/L。然而1.0 μmol/L的合成突變體R3A-JZTX-XI卻只能抑制同樣轉(zhuǎn)染表達(dá)的鈉通道 hNav1.5電流的(35.7±4.1)% (圖 4C，n=4)，其半數(shù)有效抑制濃度(IC50) 為1.96 μmol/L (圖4D)。比較上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體 R3A-JZTX-XI對(duì)鈉通道亞型 hNav1.5的抑制活性比天然nJZTX-XI降低了約4.5倍，表明JZTX-XI分子中第3位的精氨酸殘基是與Nav1.5通道結(jié)合活性相關(guān)的氨基酸殘基。

圖4 JZTX-XI與突變體R3A-JZTX-XI對(duì)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞hNav1.5通道電流的抑制作用Fig. 4 Effects of nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI on hNav1.5 channel currents expressed in HEK293T cells. Nav1.5 currents traces were evoked by a 50 ms depolarization to ?10 mV from a holding potential of ?80 mV. Every data point (±s) came from 3?5 separated experimental cells. A, B and C showed that 1.0 μmol/L nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI could inhibit hNav1.5 channel currents expressed in HEK293T cells, and they reduced Nav1.5 currents by (70.4±3.1)% (n=5), (67.5±4.2)% (n=5) and (35.7±4.1)% (n=4), respectively. D showed that the IC50 values of sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI were 437.12 nmol/L and 1.96 μmol/L, respectively.

2.4 JZTX-XI和 R3A-JZTX-XI對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞的hKv2.1通道活性的影響

進(jìn)一步研究了天然 JZTX-XI及其突變體R3A-JZTX-XI對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞上的電壓門控鉀通道亞型hKv2.1的抑制作用。電流去極化誘導(dǎo)方式：細(xì)胞膜電位鉗制?80 mV，以300 ms的時(shí)程給予一測(cè)試電壓+30 mV，每隔 5 s重復(fù) 1次。膜片鉗實(shí)驗(yàn)表明，100 nmol/L天然 JZTX-XI (nJZTX-XI)、合成 JZTX-XI (sJZTX-XI) 和突變體R3A-JZTX-XI對(duì)hKv2.1鉀通道電流的抑制程度分別為 (53.9±7.8)% (圖 5A，n=5)、(51.2±5.4)% (圖5B，n=5) 和 (5.7±3.1)% (圖 5C，n=4)。如圖 5D所示，sJZTX-XI和R3A-JZTX-XI對(duì)hKv2.1鉀電流的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)，具有明顯的濃度依從性，其半數(shù)有效抑制濃度 (IC50) 分別為95.8 nmol/L和1.22 μmol/L。比較上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體R3A-JZTX-XI對(duì)hKv2.1鉀通道的抑制活性比天然JZTX-XI降低了約12.4倍，說(shuō)明第3位的精氨酸殘基是負(fù)責(zé)JZTX-XI與Kv2.1通道結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基。

圖5 JZTX-XI與突變體R3A-JZTX-XI對(duì)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞hKv2.1通道電流的抑制作用Fig. 5 Effects of nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI on hKv2.1 channel currents expressed in HEK293T cells. hKv2.1 currents traces were evoked by a 300 ms depolarization to +30 mV from a holding potential of -80 mV. Every data point (±s) came from 3?5 separated experimental cells. A, B and C showed that 100 nmol/L nJZTX-XI, sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI could inhibit hKv2.1 channels currents expressed in HEK293T cells, and they reduced hKv2.1 currents by (53.9±7.8)% (n=5), (51.2±5.4)% (n=5) and (5.7±3.1)% (n=4), respectively. D showed that the IC50 values of sJZTX-XI and R3A-JZTX-XI were 95.8 nmol/L and 1.22 μmol/L, respectively.

3 討論

Kv2.1鉀離子通道是一種延遲整流型鉀通道，廣泛分布于胰島β細(xì)胞、大腦海馬和皮層神經(jīng)元細(xì)胞上，在調(diào)控胰島素分泌和腦缺血介導(dǎo)的細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮一定作用[12-13]，但目前人們對(duì)于 Kv2.1通道在細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中具體功能依然不是十分清楚，而蜘蛛毒素中存在的 Kv2.1通道抑制劑為該研究提供了合適的藥理學(xué)工具，如著名的蜘蛛毒素Hanatoxin1就是一種常用的研究 Kv2.1通道的工具試劑，但是該毒素因?yàn)槠鋸?fù)性產(chǎn)率太低很難通過(guò)合成的方法大量獲得該毒素而限制了其應(yīng)用[14]。另外一個(gè)Kv2.1鉀離子通道抑制毒素是SGTx1，該毒素可以化學(xué)合成，通過(guò)丙氨酸掃描突變研究確定了其與 Kv2.1通道發(fā)生作用的關(guān)鍵活性殘基[15]。目前Hanatoxin1、SGTx1和JZTX-XI的三維溶液結(jié)構(gòu)都已經(jīng)得到解析，單從氨基酸序列上看這 3個(gè)毒素第3位都是精氨酸殘基，而且已有研究顯示SGTx1第3位的精氨酸殘基是一個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基。本文成功合成了野生型 JZTX-XI和該毒素的突變體R3A-JZTX-XI，通過(guò)高效液相色譜與生物質(zhì)譜分析顯示合成產(chǎn)物能夠較好的折疊復(fù)性并形成 3對(duì)二硫鍵。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變體R3A-JZTX-XI對(duì)瞬時(shí)表達(dá)于HEK293T細(xì)胞的鉀通道hKv2.1電流的抑制活性比野生型毒素降低了約 12.4倍，說(shuō)明 Arg3是負(fù)責(zé) JZTX-XI與hKv2.1通道結(jié)合的關(guān)鍵活性殘基，進(jìn)一步通過(guò)三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn) Hanatoxin1、SGTx1和JZTX-XI毒素第3位的精氨酸殘?jiān)诳臻g結(jié)構(gòu)上具有保守性，提示這3個(gè)毒素分子在hKv2.1通道上可能具有相同的結(jié)合位點(diǎn)。

Nav1.5通道是一種河豚毒素不敏感型鈉離子通道，主要分布于心肌細(xì)胞上，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和腦組織中高度表達(dá)。已有的研究結(jié)果表明一些心血管、腫瘤和癲癇等疾病的發(fā)生也與Nav1.5通道有關(guān)[5]。敬釗纓毛蛛毒素-III (JZTX-III)是已經(jīng)報(bào)道過(guò)的心肌細(xì)胞鈉通道抑制劑，其半數(shù)有效抑制濃度為380 nmol/L[16]，但是該毒素第3位是谷氨酸殘基，JZTX-XI與JZTX-III在 Nav1.5通道上是否有相同的作用位點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究證明。

總之，敬釗毒素-XI是一種新型Kv2.1和Nav1.5交叉通道活性抑制劑，開(kāi)展其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究可以為深入闡明該毒素與通道相互作用的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為將來(lái)通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段移除該毒素Nav1.5通道的相關(guān)活性，使其改造成為研究胰臟鉀通道 Kv2.1的分子探針，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)以 Kv2.1通道為靶點(diǎn)相關(guān)的藥物研究提供新的思路。

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