堿性pH條件下白念珠菌鈣離子通道CCH1和MID1基因?qū)︹}內(nèi)流的影響及Crz1p轉(zhuǎn)錄因子對(duì)其的調(diào)控作用

王慧，徐寧，邢來君，李明春，魏東盛

南開大學(xué)微生物學(xué)系 分子微生物學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071

鈣離子是微生物細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)元素之一，并且在細(xì)胞內(nèi)充當(dāng)著重要的第二信使分子的角色[1-2]。真核生物細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力對(duì)其存活至關(guān)重要，酵母細(xì)胞在暴露于多數(shù)環(huán)境壓力時(shí)，如：離子饑餓[3]、高等滲壓力[4]、堿性 pH[5]以及其他信號(hào)分子 (如α-因子[6]和藥物胺碘酮[7]) 等，都會(huì)引起胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間變化。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化機(jī)制極其復(fù)雜，可能是外鈣內(nèi)流的結(jié)果，也可能是胞內(nèi)鈣庫(kù)，如液泡或高爾基體釋放鈣離子的結(jié)果。Brand等發(fā)現(xiàn)鈣離子通道 (VGCC) 電壓門控膜蛋白Cch1p和Mid1p，與白念珠菌鈣內(nèi)流有關(guān)[8]。胞外鈣離子通過Cch1p和Mid1p進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的瞬間變化進(jìn)而激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 (CaN)，使得轉(zhuǎn)錄因子 Crz1p去磷酸化，與CDRE (CaN依賴性的應(yīng)答元件) 結(jié)合來進(jìn)一步激活下游的應(yīng)答基因，隨后將胞內(nèi)的鈣離子濃度降低到變化前的水平[5]。

微生物體必須在環(huán)境變化的適應(yīng)過程中存活，這對(duì)于人體條件致病性真菌白念珠菌尤為重要。pH是一種重要的生理環(huán)境壓力條件，對(duì)白念珠菌的形態(tài)有顯著影響，細(xì)胞對(duì)環(huán)境pH的適應(yīng)能力對(duì)其致病性至關(guān)重要[9]。酵母細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡與pH密切相關(guān)，在釀酒酵母中對(duì)堿性pH轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的研究首次給出鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo) pH壓力應(yīng)答的證據(jù)。DNA微陣列數(shù)據(jù)[10]表明在堿性pH條件下，共有150個(gè)pH依賴性的基因在mRNA水平上表達(dá)上調(diào)至少2倍。堿性pH條件誘導(dǎo)的許多基因的表達(dá)在CNA1/CNB1或CRZ1基因缺失的菌株中下調(diào)，甚至在添加CaN的免疫抑制劑藥物FK506時(shí)完全受到抑制。對(duì) ENA1啟動(dòng)子元件分析的結(jié)果表明，在其中有2個(gè)pH應(yīng)答區(qū)，包含著最小的CDRE元件，來激活堿性pH條件引發(fā)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答?？梢姡遭}離子信號(hào)作為信使，轉(zhuǎn)錄因子 Crz1p介導(dǎo)的鈣信號(hào)途徑是pH壓力應(yīng)答中的重要途徑。

為了研究鈣信號(hào)途徑在堿性 pH條件應(yīng)答中的重要作用，本文構(gòu)建了鈣通道基因 CCH1和 MID1的缺失突變株，研究其在堿性pH條件下對(duì)鈣內(nèi)流的影響。微生物細(xì)胞胞內(nèi)鈣濃度變化的測(cè)定方法很多，其中鈣發(fā)光蛋白指示法[11]有過多次報(bào)道，然而很少使用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)酵母細(xì)胞中鈣離子的變化。本文利用流式細(xì)胞術(shù)在全細(xì)胞水平上測(cè)定堿性 pH條件下胞內(nèi)鈣波變化的動(dòng)力學(xué)，分析CCH1和MID1缺失對(duì)鈣內(nèi)流的影響，通過 β-半乳糖苷酶體系和實(shí)時(shí)定量PCR方法進(jìn)一步追蹤C(jī)rz1p轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用。總之，對(duì)鈣信號(hào)途徑的研究將有助于加深對(duì)白念珠菌堿性pH應(yīng)答機(jī)制的了解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Taq、Taq plus、long Taq DNA聚合酶、常用限制性內(nèi)切酶購(gòu)于 TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BspQⅠ、NogM Ⅳ和 AseⅠ購(gòu)于 NEB公司；pGEM-T Easy Vector、T4 DNA連接酶及反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于 Promega北京生物技術(shù)有限公司；DNA快速純化/回收試劑盒、M199培養(yǎng)基、ONPG和dNTPs等購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)化使用試劑PEG3350、LiAc以及鈣離子螯合劑EGTA和鈣探針Fluo-3AM購(gòu)于Sigma公司；熒光定量PCR使用天根公司的 SYBR-Green試劑盒。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所有引物均由北京奧科公司合成。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒和引物

實(shí)驗(yàn)使用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物見表2。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。白念珠菌培養(yǎng)使用的所有培養(yǎng)基(SC-ura除外) 均添加終濃度80 μg/mL尿苷。YPD培養(yǎng)基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。SC培養(yǎng)基：0.67%無氨基酵母氮源，0.2%省卻混合物粉末，2%葡萄糖。M199培養(yǎng)基：M199粉末一袋，150 mmol/L HEPES，80 μg/mL尿苷，調(diào)溶液的pH至 4或 8，抽濾除菌。鈣離子螯合劑 EGTA配成100 mmol/L貯液，過濾后添加到培養(yǎng)基中使終濃度達(dá)到10 mmol/L，形成鈣離子缺陷的培養(yǎng)條件，CaN的免疫抑制劑FK506配成1 mg/mL貯液，添加到培養(yǎng)基的終濃度為1 μg/mL，CaCl2配成1mol/L貯液，添加時(shí)終濃度為200 mmol/L。

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2 白念珠菌基因的敲除

使用二步法PCR介導(dǎo)的基因敲除的方法[12]。分別以質(zhì)粒 pRS-Arg?SpeI和 pDDB57為模板，MID1/CCH1-5DR和3DR為引物，通過PCR獲得含有ARG4或URA3選擇性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化野生型菌株 DAY1。白念珠菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化使用醋酸鋰法，具體方法參見文獻(xiàn)[13]。使用MID1/CCH1-5detect和3detect引物通過PCR的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的鑒定。

1.3 Fluo-3熒光染料負(fù)載及流式細(xì)胞術(shù)測(cè)鈣

離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用 HBSS緩沖液(氯化鉀0.4 g/L、氯化鈉8.77 g/L、六水合氯化鎂0.2 g/L、氯化鈣 0.22 g/L、HEPES 2.38 g/L、葡萄糖1.98 g/L，pH 7.0) 洗滌細(xì)胞，熒光染料Fluo-3AM貯液用20% Pluronic F-127 DMSO溶解至濃度為1 mg/mL，使用時(shí)終濃度為5 μg/mL。加染料的細(xì)胞置于37 ℃避光孵育50 min，負(fù)載后用HBSS洗滌細(xì)胞3次。使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定胞內(nèi)鈣離子濃度，在加入刺激物質(zhì)前，鈣離子的熒光值平穩(wěn)，顯示為基線，30 s后加入KOH或HCl，混勻流式管中的細(xì)胞后跟蹤細(xì)胞內(nèi)鈣離子的動(dòng)態(tài)變化482 s，總時(shí)間為512 s。數(shù)據(jù)使用Winmdi 2.9軟件進(jìn)行分析。

1.4 pPHO89-LacZ-His重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用PHO89-Pdistal和PHO89-ATG引物擴(kuò)增得到PHO89啟動(dòng)子，終質(zhì)粒pPHO89-LacZ-His的構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)[14]。

1.5 β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

轉(zhuǎn)化不同菌株的 pPHO89-LacZ-His質(zhì)粒，在SC-His缺陷培養(yǎng)基上篩選正確轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子接種于30 mL不同條件的M199培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.8~1.0時(shí)收集菌體，β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定具體步驟見文獻(xiàn)[13]，β-半乳糖苷酶的活性計(jì)算公式，OD420×1 000/[OD600×t (min)×3(稀釋因子)]，單位為Miller，每組數(shù)據(jù)的獲得均來自至少3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

1.6 白念珠菌總RNA提取

將白念珠菌接種至3 mL M199 (pH 7) 培養(yǎng)基中，30 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。稀釋過夜培養(yǎng)的菌液，轉(zhuǎn)接至50 mL M199 (pH 4或pH 8)培養(yǎng)基中，起始OD600≈0.1，30 ℃振蕩培養(yǎng)至 OD600≈0.6~0.8，離心收集菌體，洗滌后液氮凍存。使用玻璃珠破壁的方法提取RNA[15]。提取的RNA樣品保存于?80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.7 cDNA的合成和熒光定量PCR

使用Promega公司的Oligo(dT) 引導(dǎo)cDNA第一鏈的合成，反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃，30 min使引物結(jié)合；42 ℃、1 h進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；70 ℃、15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA樣品在?80 ℃保存，熒光定量PCR使用Bio-rad IQ5儀器，ACT1-5RT和ACT1-3RT引物用于ACT1的擴(kuò)增，MID1-5RT/3RT、CCH1-5RT/3RT引物分別來擴(kuò)增MID1和CCH1基因，每個(gè)反應(yīng)設(shè)4個(gè)平行。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，68 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR完成后，溫度從58 ℃升至94 ℃，儀器自動(dòng)收集熒光信號(hào)，得到融解曲線。進(jìn)行 3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)后，使用Bio-radIQ5軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算MID1和CCH1的Threshold cycle (Ct值)，使用內(nèi)參基因ACT1的Ct值矯正目的基因的Ct值得到 ?Ct值，然后進(jìn)一步比較野生型菌株和缺失突變株中同一基因的 Ct值得到 ??Ct值，基因相對(duì)表達(dá)量使用2???Ct方法計(jì)算[16]。

2 結(jié)果

2.1 白念珠菌CCH1和MID1基因缺失突變株的構(gòu)建

CCH1和MID1基因雜合缺失突變株比較容易獲得，挑取 SC-Arg選擇性平板上的轉(zhuǎn)化子，分別提取基因組DNA，進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定。結(jié)果顯示：對(duì)于CCH1，篩選的14個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有11個(gè)出現(xiàn)3.8 kb的CCH1基因野生型條帶和2.3 kb的ARG4條帶 (圖1A，泳道3)，獲得雜合子的陽(yáng)性率為78.6%。對(duì)于MID1，篩選的21個(gè)轉(zhuǎn)化子中，有17個(gè)出現(xiàn)1.7 kb的MID1基因野生型條帶和2.4 kb的ARG4條帶 (圖1B，泳道2)，獲得雜合子的陽(yáng)性率為 80.9%。但是純合突變株不易獲得，第 2次重組后大部分轉(zhuǎn)化子是由 URA3替換了 ARG4造成的雜合突變株，從SC-Ura平板分別篩選了75個(gè)CCH1和80個(gè)MID1的轉(zhuǎn)化子，僅獲得1株純合突變株cch1::ARG4/cch1::URA3 (圖1A，泳道1) 和mid1::ARG4/mid1::URA3 (圖1B，泳道3)，陽(yáng)性率分別為1.33%和1.25%。

圖1 CCH1和MID1基因缺失突變株的PCR檢測(cè)Fig. 1 PCR confirmation of CCH1 and MID1 mutants. (A) 1: NKC73 (cch1::ARG4/cch1::URA3); 2: wild type; 3: NKC72 (cch1::ARG4/CCH1). (B): 1: wild type; 2: NKC67 (mid1::ARG4/MID1); 3: NKC68 (mid1::ARG4/mid1::URA3); M: marker Ш 4.5 kb, 3.0 kb, 2.0 kb, 1.2 kb, 800 bp from top to bottom.

2.2 堿性 pH 條件引起胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間變化以及CCH1和MID1基因缺失對(duì)鈣波變化的影響分析

經(jīng)Fluo-3AM負(fù)載的細(xì)胞上流式管，圖2A為白念珠菌DAY1細(xì)胞FSC/SSC散點(diǎn)圖，圖中細(xì)胞最為集中的R1區(qū)域設(shè)定為研究范圍。野生型白念珠菌細(xì)胞受到3 mol/L KOH刺激后，由于胞內(nèi)的pH由中性變?yōu)閴A性，200 s內(nèi)即可看到明顯的鈣峰出現(xiàn)，而在250 s后胞內(nèi)鈣離子濃度又回到刺激前的基線水平(圖2B)。使用6 mmol/L的HCl刺激同樣的細(xì)胞，使胞內(nèi) pH由中性變?yōu)樗嵝?，卻沒有明顯的鈣峰出現(xiàn)(圖 2C)。為了進(jìn)一步研究 pH對(duì)胞內(nèi)鈣波變化的影響，使用不同濃度的KOH和HCl刺激DAY1細(xì)胞，比較每一種 pH條件下鈣波變化區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度值與最大變化區(qū)域值的比值來確定能引起鈣波變化最為顯著的pH條件范圍。從圖2D可以看出，當(dāng)胞外pH達(dá)到7.5時(shí)，比值大于50%，證明開始出現(xiàn)了較為明顯的鈣波變化并且在pH 8.2時(shí)達(dá)到最大，在pH 8.5后，這種變化又逐漸減弱，表明不同pH引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間變化是劑量依賴性的。我們使用同樣濃度的 KOH刺激 cch1?/?和mid1?/?細(xì)胞 (圖2E、2F)，使胞內(nèi)的pH達(dá)到8.2，但并沒有看到明顯的鈣峰出現(xiàn)，表明CCH1和MID1基因缺失影響了堿性pH條件下鈣離子的內(nèi)流。

圖2 不同pH條件下鈣波變化的動(dòng)力學(xué)及cch1?/?和mid1?/?對(duì)堿性pH條件下鈣內(nèi)流的影響Fig. 2 Kinetics of the calcium fluctuation in response to different pH and effect of cch1?/? and mid1?/? mutants on calcium fluctuation in response to alkaline stress.

2.3 CCH1和MID1基因缺失對(duì)PHO89-LacZ活性的影響分析

PHO89是一個(gè)堿性pH應(yīng)答基因，且它的激活要通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶途徑[11]。如果堿性 pH能引起胞內(nèi)鈣濃度的瞬間升高，我們推測(cè)許多鈣離子或CaN應(yīng)答的啟動(dòng)子將會(huì)被激活，而在鈣離子濃度沒有發(fā)生變化的情況下，啟動(dòng)子無應(yīng)答。為證實(shí)這種假設(shè)，我們構(gòu)建了PHO89-LacZ-His報(bào)告基因并將其分別轉(zhuǎn)化DAY1、cch1?/?和mid1?/?，利用β-半乳糖苷酶報(bào)告體系，通過比較不同pH以及不同鈣濃度條件下啟動(dòng)子活性的強(qiáng)弱來分析CCH1和MID1基因缺失對(duì)PHO89-LacZ活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1) 在pH 4條件下，PHO89啟動(dòng)子幾乎無應(yīng)答，只有較低的 LacZ活性，但是添加 Ca2+后，LacZ活性在野生型菌株中上升了10倍，在突變株中也上升了2~5倍。2) 在pH 8條件下，cch1?/?和mid1?/?中 LacZ活性比野生型菌株中的活性下降近 2倍(圖3)，說明堿性pH條件下缺失突變株對(duì)鈣離子濃度變化的影響直接影響到了PHO89啟動(dòng)子的活性，而在pH8+EGTA條件下LacZ活性的明顯下降進(jìn)一步說明PHO89-LacZ活性是鈣離子依賴性的。

2.4 Crz1p轉(zhuǎn)錄因子對(duì)鈣離子依賴性的 PHO89-LacZ活性的調(diào)控作用

Crz1p是鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的核心，為了研究這種堿性pH誘導(dǎo)的鈣離子依賴性的PHO89-LacZ活性是否受到轉(zhuǎn)錄因子Crz1的調(diào)控作用，我們將含報(bào)告基因的質(zhì)粒進(jìn)一步轉(zhuǎn)化了crz1?/?菌株，并且在pH 4和pH 8兩種背景環(huán)境下，同時(shí)添加Ca2+和EGTA，以及CaN的免疫抑制劑FK506，通過測(cè)定12種條件下 LacZ的活性，比較野生型和突變型菌株中 β-半乳糖苷酶的活性差異，來分析 Crz1p轉(zhuǎn)錄因子對(duì)鈣離子依賴性的 PHO89-LacZ活性的調(diào)控作用。從圖4可以看出，1) 在crz1?/?菌株中，兩種pH條件時(shí)無論是否添加 Ca2+或藥物 FK506，都沒有明顯的 LacZ活性，證明PHO89啟動(dòng)子的活性是受到 Crz1p正向調(diào)控的；2) 野生型菌株中，pH 4和pH 4+FK506這兩種條件下，只能檢測(cè)到較低的LacZ活性，補(bǔ)加Ca2+后，LacZ活性上升10倍，但由于FK506的添加，LacZ活性又下降了2倍；相比較酸性條件 (pH 4)，堿性條件下 (pH 8) 無論是否添加FK506都有較高LacZ活性，但在添加Ca2+螯合劑 EGTA后，LacZ活性明顯下降，而且 FK506的添加使得LacZ活性又下降了2倍。綜上可以得出，堿性pH壓力下鈣離子誘導(dǎo)的PHO89啟動(dòng)子的激活是CaN/Crz1p依賴的。

圖3 含 PHO89-LacZ片段的野生型和缺失突變株在不同培養(yǎng)條件下的β-半乳糖苷酶活性分析Fig. 3 β-Galactosidase activity analysis of PHO89-LacZ band containing wild type and mutant strains.

圖4 Crz1p對(duì)堿性pH壓力下鈣離子誘導(dǎo)的PHO89啟動(dòng)子的調(diào)控作用Fig. 4 Regulating role of Crz1p in activation of calciumresponsive PHO89 promoter under alkaline stress.

2.5 Crz1p轉(zhuǎn)錄因子對(duì)鈣通道基因CCH1和MID1的調(diào)控作用

對(duì)堿性pH的應(yīng)答需要Rim101p、Crz1p和CaN，并且依賴于許多Na+-ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)。例如，在白念珠菌中，ENA2受到Rim101的嚴(yán)格調(diào)控，但是 Crz1在堿性 pH應(yīng)答中似乎需要更多的除Na+-ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)體基因以外的靶點(diǎn)[10]。CCH1和MID1基因作為鈣離子內(nèi)流的通道，是CaN激活必需的，而cch1?/?和mid1?/?在堿性pH條件下對(duì)鈣內(nèi)流以及對(duì) PHO89-LacZ活性的影響，很大程度是由于CaN沒有被激活。因此，我們推測(cè)為了應(yīng)答堿性pH，Crz1p對(duì)CCH1和MID1基因也具有一定的調(diào)控作用。

通過熒光定量PCR，我們比較了pH 4和pH 8兩種條件下 CCH1和 MID1基因在野生型菌株和crz1?/?缺失菌株中的表達(dá)差異，從圖5中的結(jié)果可以看出，在 pH 8條件下，CCH1和 MID1基因在crz1?/?缺失菌株中的表達(dá)量都有顯著下降，是其在野生型菌株中的 40%~60%，添加藥物 FK506對(duì)CCH1和MID1基因的表達(dá)沒有明顯影響，證明堿性pH條件下CCH1和MID1基因的表達(dá)受到Crz1p轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)控作用，但非 CaN依賴。而在pH 4條件下，CCH1和MID1基因在crz1?/?缺失菌株中的表達(dá)量與其在野生型菌株中沒有太大的差異，但是藥物 FK506的添加，使其表達(dá)量下降了將近50%，說明CaN對(duì)酸性pH條件誘導(dǎo)的CCH1和MID1基因的表達(dá)是必需的。

圖5 CCH1和MID1基因在野生型菌株和crz1?/?缺失菌株中的表達(dá)差異Fig. 5 Differential expression of Candida albicans MID1 and CCH1 in wild type and crz1?/? mutant strains.

3 討論

真核生物細(xì)胞能夠通過許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制來對(duì)各種各樣的環(huán)境壓力變化作出應(yīng)答，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CaN/Crz1途徑在pH變化過程中調(diào)控離子的動(dòng)態(tài)平衡[17]。本文重點(diǎn)研究了以Cch1p/Mid1p通道為起點(diǎn)影響堿性 pH壓力條件下的鈣內(nèi)流，以及 Crz1p為核心對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控的鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在堿性pH壓力應(yīng)答中的重要作用。實(shí)驗(yàn)中首先需要解決的問題是尋找合適的方法測(cè)定堿性 pH條件對(duì)白念珠菌細(xì)胞胞內(nèi)鈣波變化的影響，而報(bào)道較多的鈣發(fā)光蛋白法、Fura-2熒光指示劑負(fù)載法，或是使用單細(xì)胞鈣離子成像分析系統(tǒng)測(cè)定胞內(nèi)鈣離子濃度變化的方法，都只能反映單個(gè)細(xì)胞在環(huán)境變化下胞內(nèi)鈣波變化的情況，卻不能代表整體細(xì)胞的平均水平。本文結(jié)合 Fluo-3AM熒光染料負(fù)載與流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)堿性pH壓力下胞內(nèi)鈣波變化動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)，是微生物細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子測(cè)定方法的重要改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞水平，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為科學(xué)、可信。

實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)堿性pH條件能引起胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間變化并且這種變化在 cch1?/?和mid1?/?突變株中消失，Cch1p和Mid1p作為酵母細(xì)胞膜上高親和力的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通道，能夠?qū)獾拟}運(yùn)送至胞內(nèi)，CCH1和MID1基因的缺失必然會(huì)導(dǎo)致這種鈣內(nèi)流受阻。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了CCH1和MID1基因在堿性pH誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間升高過程中發(fā)揮著重要的作用，但這并不排除胞內(nèi)鈣庫(kù)可能向細(xì)胞中釋放鈣離子，從而引起胞內(nèi)鈣濃度升高的可能性，高的等滲壓力就能夠誘導(dǎo)液泡通過Yvc1p向胞內(nèi)釋放鈣離子[18]。在釀酒酵母中，P-型ATP酶Pmr1p轉(zhuǎn)運(yùn)體能夠?qū)a2+和Mn2+運(yùn)送回高爾基體，PMR1基因的缺失也可能會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度的積累[19]。所以本實(shí)驗(yàn)也使用同樣的方法分析了保存的 yvc1?/?和 pmr1?/?突變株在堿性pH條件下胞內(nèi)的鈣波變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變菌株與野生型菌株中的鈣波變化基本一致，再次證明CCH1和MID1基因在鈣離子動(dòng)態(tài)平衡和堿性pH條件下外鈣內(nèi)流的調(diào)控過程中的重要作用。

Crz1p是酵母細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的核心轉(zhuǎn)錄因子，能夠特異性地與一個(gè)24 bp的CDRE序列結(jié)合，這對(duì)于鈣離子誘導(dǎo)的、CaN依賴的基因表達(dá)是必不可少的[20]。在堿性pH條件下，PHO89基因的表達(dá)上調(diào)，在其啟動(dòng)子序列中很可能含有CDRE，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一點(diǎn)，β-半乳糖苷酶體系的建立一方面說明了pPHO89-LacZ的表達(dá)是鈣離子依賴性的，另一方面在 crz1?/? 突變菌株中啟動(dòng)子應(yīng)答的消失以及在野生型菌株中添加FK506后LacZ活性的減弱，證明PHO89基因的表達(dá)是受到Crz1p嚴(yán)格調(diào)控的，并且是CaN依賴性的。既然Crz1p對(duì)堿性pH應(yīng)答基因具有調(diào)控作用，鑒于其在鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心角色，而CCH1和MID1基因作為壓力變化時(shí)鈣離子信號(hào)傳遞的重要通道因子，我們推測(cè)Crz1p對(duì)CCH1和MID1基因也具有一定的調(diào)控作用，所以最后利用熒光定量PCR證實(shí)了這一點(diǎn)，但是Crz1p對(duì)CCH1和MID1基因的調(diào)控作用不是CaN依賴性的。

總之，白念珠菌對(duì)環(huán)境pH的應(yīng)答與其致病性密切相關(guān)，對(duì)鈣信號(hào)途徑在堿性pH壓力應(yīng)答中作用的研究將有助于我們進(jìn)一步了解這種在醫(yī)學(xué)上極為重要的病原菌是如何在宿主中存活的，對(duì)臨床上念珠菌感染的治療和新藥物靶點(diǎn)導(dǎo)向具有重要的理論和實(shí)際意義。

致謝：本實(shí)驗(yàn)中的部分菌株和質(zhì)粒由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)Dr. Dana Davis教授惠贈(zèng)，在此表示衷心感謝！

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