非小細(xì)胞肺癌EGFR突變的檢測方法

張鑫宇 劉皈陽 祝曉光 王偉蘭

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤。近年來表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptortyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）為NSCLC的治療帶來新的曙光，但用藥前必須依據(jù)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）的突變檢測結(jié)果選擇治療對象[1-4]。因此EGFR突變成為肺癌患者應(yīng)用TKI有無療效的關(guān)鍵因素。探索和建立快速準(zhǔn)確檢測NSCLC患者EGFR基因突變的方法，有助于篩選出適合治療的人群，具有較好的臨床意義。從目前收集到的資料來看，EGFR突變檢測的方法多種多樣，主要有PCR（polymerase chain rection）-直接測序法[5]、PCR-TaqMan法[6-9]、變性高效液相色譜法（denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC）[10-12]、蝎形探針擴增阻滯突變系統(tǒng)法（scorpions amplification refractory mutation system, SARMS）[6,13-19]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP）法[16,20]、酶切富集PCR法[21-23]及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction-restriction-fragment length polymorphism, PCR-RFLP）法[24]等[25,26]。奉水東等[27]2008年針對肺癌EGFR基因突變檢測方法進行過討論，但未對各種方法適用范圍進行詳細(xì)比較，加之近幾年又出現(xiàn)了一些新的技術(shù)方法，尤為表現(xiàn)在檢測樣本的范圍拓展方面。因此本文就上述方法進行綜述。

1 各種方法檢測原理

無論是哪一種方法，首先都要進行樣本DNA的提取，樣本類型主要包括手術(shù)切除或CT引導(dǎo)下穿刺獲取的腫瘤組織、癌性胸腔積液以及外周血等。為得到足量、穩(wěn)定、均一的DNA樣本，推薦采用DNA快速抽提純化試劑盒進行提取純化然后進行擴增檢測。

1.1 PCR-直接測序法 根據(jù)文獻(xiàn)[1,2]報道的方法，應(yīng)用PCR直接擴增EGFR基因第18、19、20、21的基因片段。擴增片段同時包含外顯子及其相連的內(nèi)含子部分。PCR反應(yīng)條件為變性95oC、15 min；變性94oC、30 s，退火65oC、30 s和延伸72oC、1 min，35個循環(huán)；最后延伸72oC、5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增片段，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物進行正反兩個方向測序。分析測序圖譜，判斷EGFR基因第18、19、20、2l外顯子突變區(qū)域是EGFR突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 PCR-TaqMan法 根據(jù)文獻(xiàn)[1,2]報道的方法，設(shè)計針對EGFR基因19外顯子4個缺失區(qū)域的檢測探針（突變型探針）、針對第21外顯子L858R突變和18外顯子G719C點突變檢測探針；同時設(shè)計相應(yīng)的基因野生型檢測探針。探針的5′端采用FAM、TET和HEX熒光染料進行標(biāo)記，3′端與非熒光淬滅分子（minor groove binder, MGB）相連接。使用Lightcylcer PCR和反應(yīng)體系進行實時PCR擴增，PCR條件為94oC變性3 min，94oC、5 s，60oC、30 s，循環(huán)50次。530 nm下實時監(jiān)測產(chǎn)物。

MGB技術(shù)則利用與雙鏈DNA的小溝的高度親和力增加寡核苷酸探針結(jié)合到單鏈模板DNA上的穩(wěn)定性，提高探針Tm值，縮短了探針的設(shè)計長度，增加配對與非配對時Tm上的差異，改善探針的特異性與敏感性，對單核苷酸突變檢測更為有效。

1.3 DHPLC DHPLC檢測使用WAVE4500核苷酸分析系統(tǒng)，色譜柱為DNA SepCartridge分離柱，流動相為不同濃度的乙腈與三乙基銨醋酸鹽（triethylamine acetate,TEAA）配制的洗脫液，由控制軟件WAVE Maker根據(jù)待測DNA序列自動生成乙腈梯度和柱溫，以0.9 mL/min流速測定，PCR產(chǎn)物不作任何純化處理，直接用于DHPLC分析。 19外顯子突變類型為15 bp-18 bp堿基刪除突變，采用非變性條件在50oC條件下對片段長度進行測定 ，野生型產(chǎn)物為151 bp，刪除突變產(chǎn)物由于片段較短（136 bp-133 bp）會先于野生型產(chǎn)物出現(xiàn)而與野生型峰明顯分離。外顯子21的突變類型為L858置換突變采用部分變性溫度進行測定，先將PCR產(chǎn)物變性復(fù)性處理，若存在突變會形成雜合雙鏈，其退火溫度低于純和雙鏈，61oC部分變性條件下可將產(chǎn)物分離。將測序陽性的標(biāo)本作為陽性對照，以注射用水作為空白對照。

1.4 SARMS ARMS（amplification refractory mutation system）擴增阻滯突變系統(tǒng)技術(shù)用于等位基因的鑒定，附加錯配突變設(shè)計在3′端引物序列中，從而實現(xiàn)特異性的擴增。Scorpions為蝎形結(jié)構(gòu)的特異性探針，包含一個與3′端共價相連的PCR引物，引物僅僅識別突變序列，而不識別正常序列，在即時PCR反應(yīng)中，當(dāng)探針與擴增子（即突變序列）連接進行擴增時，熒光基團與淬滅基團分離，反應(yīng)試劑中熒光度增強。Scorpions與ARMS技術(shù)聯(lián)和應(yīng)用（SARMS）可檢測單個突變，對于已知基因的檢測，SARMS具有高度的敏感性[13,28,29]。

現(xiàn)今英國的Delivering Pharmacogenomics公司推出的EGFR突變檢測試劑盒（即EGFR Scorpion Kit；DxS Ltd.Manchester，英國），可檢測EGFR外顯子18、19、20、21四個外顯子的29種體細(xì)胞突變。

1.5 PCR-SSCP PCR-SSCP[20]是一種經(jīng)典的檢測基因突變的方法，原理為：單鏈DNA因鏈內(nèi)堿基配對而具有一定的空間構(gòu)象，當(dāng)DNA鏈上的堿基發(fā)生改變時，單鏈DNA會形成不同的構(gòu)象，即單鏈構(gòu)象多態(tài)性。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，不同構(gòu)象的DNA分子具有不同的泳動速度。單鏈DNA分子的相對遷移率不僅與DNA分子的大小有關(guān)，而且與其構(gòu)象有關(guān)。

1.6 酶切富集PCR法 酶切富集PCR法是進行核酸擴增的有效方法。該方法基于已知的突變類型設(shè)計相應(yīng)的引物，然后根據(jù)PCR產(chǎn)物的性質(zhì)（有無或大?。﹣砼袛嗵禺愋酝蛔兊拇嬖?。一般分兩步進行，首先利用限制性內(nèi)切酶去選擇性消化野生型的EGFR基因片斷，從而使反應(yīng)體系中突變型EGFR基因片斷得到富集，再通過PCR放大和凝膠電泳來進行突變的判斷。

1.7 PCR-RFLP PCR-RFLP是在PCR和DNA序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的RFLP技術(shù)。該方法是通過PCR擴增一段DNA片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳可得到有特異性的電泳譜帶，從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的。

1.8 其它

1.8.1 核酸肽鎖核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[25]（peptide nucleic acid-locked nucleic acid.PNA-LNA） PNA-LNA檢測EGFR基因已知位點的突變。含有野生序列的核酸肽 （PNA）和含有突變探針的鎖核酸（LNA）被使用去構(gòu)建PCR夾，因為PNA引物只能結(jié)合在野生序列上而不能與突變序列結(jié)合，從而起到了選擇性地阻止PCR引物擴增野生序列的作用，即 “鎖”的功能。該法降低了對檢測組織的要求，大大提高了突變檢測的靈敏度。

1.8.2 輕鏈PCR[26]輕鏈PCR方法采用探針雜交方式進行DNA檢測和定量的熒光PCR技術(shù)。在反應(yīng)成分中，除了常規(guī)PCR的反應(yīng)成分外，還包括兩條標(biāo)記有熒光基團的寡聚核苷酸探針，這兩條寡聚核苷酸探針均與DNA模板的堿基配對，而且其中一條探針的3′端標(biāo)記了熒光基團（熒光素），而另一條探針則在5′端標(biāo)記了熒光基團，當(dāng)兩個基團之間只有1個-5個堿基的距離時，便發(fā)生了高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在PCR反應(yīng)進行到退火步驟時，兩條寡聚核苷酸探針與DNA模板雜交，第一條探針的熒光基團（熒光素）受到光源的照射發(fā)出一種綠色熒光，由于兩個熒光基團的距離相當(dāng)小，因此便發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，從而激發(fā)了另一個熒光基團發(fā)出更強的紅色熒光信號，當(dāng)DNA模板量增加時，熒光基團發(fā)出的熒光信號也隨之增加，因此在退火階段檢測的熒光信號的強度便可以檢測相應(yīng)的DNA模板數(shù)量，實現(xiàn)了目的基因的定量檢測。

2 方法之間的比較

2.1 樣本要求 直接測序法要求樣本為腫瘤組織[13,23]，是因為直接測序法的敏感性不高，不宜用于腫瘤組織外其它樣本。Guo[6]等對此解釋為非組織樣本中濃縮提取的DNA難以達(dá)到分光光度法所能檢測的最低限度，從而導(dǎo)致小劑量低比例的腫瘤衍生DNA被直接測序法誤判為EGFR突變野生型。許多研究[14,19,21,30]都證實了這一說法。其它方法中PCR-SSCP法和PCR-RFLP法僅見到用于腫瘤組織檢測，未見有在其它標(biāo)本中檢測介紹。PCR-TaqMan法、DHPLC法、SARMS法、酶切富集PCR法均有腫瘤組織標(biāo)本外樣本相關(guān)研究介紹。其中DHPLC法、SARMS法和酶切富集PCR法被用于比較配對腫瘤組織和外周血樣本EGFR突變比較的研究。

2.2 檢測結(jié)果

2.2.1 腫瘤組織 腫瘤組織樣本中上述方法均與直接測序法進行過配對比較，PCR-TaqMan法與直接測序法的檢測一致率達(dá)到95%以上[8,9,31]，而且PCR-TaqMan法敏感性在個別報道中還略高于直接測序法，白樺等[10]研究了230例晚期NSCLC患者外周血和腫瘤組織配對樣本，結(jié)果顯示腫瘤組織中DHPLC法與直接測序法相比靈敏度與特異度分別為96.9%和91.9%。陳思遠(yuǎn)等[11]也進行了類似研究，證實了兩種方法中DHPLC法靈敏度為100%，特異度為95.31%，陽性一致率為86.36%。張靜等[18]采用SARMS法和直接測序法檢測了82例NSCLC組織EGFR突變情況，結(jié)果SARMS法檢測到了82例中42例存在EGFR突變，突變率為51.2%，PCR后直接測序僅獲得58例可分析的測序結(jié)果，其中25例出現(xiàn)突變，突變率為30.5%，而且直接測序檢測出的25例突變模式與SARMS法檢測結(jié)果相一致。Horiike等[19]利用支氣管穿刺得到的樣本對比了上述兩種方法，結(jié)果與張靜等[18]的研究結(jié)論一致，都顯示出SARMS方法比直接測序法敏感優(yōu)越。Marchetti等[16]入組了860例NSCLC患者的腫瘤組織，采用PCR-直接測序法和PCR-SSCP法進行檢測，其中454例鱗癌和31例大細(xì)胞癌未見到EGFR突變，375例腺癌中PCR-SSCP法檢測到39例出現(xiàn)突變，突變率達(dá)10%，低于正常突變率25%-35%，可能原因與入組患者特點有關(guān)，而其中21%的突變經(jīng)直接測序法未能檢測到，與測序法相比該方法敏感性高，可以發(fā)現(xiàn)測序未能發(fā)現(xiàn)的突變。Asano等[21]比較了酶切富集PCR法和直接測序法在手術(shù)切除的腫瘤組織、CT引導(dǎo)下穿刺得到的肺組織和胸水這三種樣本中檢測的一致性情況，結(jié)果顯示手術(shù)切除的組織中兩種方法一致性最好，其它兩種樣本中酶切法遠(yuǎn)高于直接測序法。

2.2.2 配對腫瘤組織和外周血樣本 白樺等[10]采用DHPLC法對230例晚期NSCLC患者外周血和腫瘤組織配對樣本進行突變檢測，結(jié)果顯示外周血與腫瘤組織突變陽性檢測一致率為79.7%。Kimura等[15]應(yīng)用SARMS方法檢測42例配對腫瘤組織和外周血突變情況，結(jié)果在兩種樣本中，突變一致率達(dá)到92.9%，可見SARMS方法具有高度敏感性。何臣等[23]報道了酶切富集法檢測18例外周血和組織學(xué)配對樣本，結(jié)果兩種樣本一致率為94.4%，陽性一致率為87.5%。

2.2.3 配對胸腔積液和外周血樣本 何臣等[32]也利用酶切法檢測了30例胸腔積液中（15例血漿標(biāo)本配對）EGFR突變情況，結(jié)果配對樣本中陽性一致率為87.5%。

2.3 敏感性 直接測序法敏感性不低于30%突變拷貝數(shù)[33,34]，PCR-TaqMan法不低于10%[6]、DHPLC法5%左右[10,35-37]、SARMS法為1%[15]、PCR-SSCP法為10%[33,34]、酶切富集法PCR法1%[31]，PCR-RFLP法1%[24]。

2.4 檢測范圍 EGFR突變主要表現(xiàn)在18-21位點，尤其是19、21外顯子敏感突變和20外顯子的耐藥突變，上述方法中直接測序法在樣本類型和樣本量理想化的前提下檢測范圍最為廣泛，可檢測EGFR外顯子18、19、20、21四個外顯子處的29種體細(xì)胞突變[1,2]。PCR-TaqMan法存在探針設(shè)計的局限性，未發(fā)現(xiàn)針對20外顯子突變設(shè)計的探針，不能像直接測序法那樣一目了然地發(fā)現(xiàn)EGFR外顯子18-21位各種不同類型的突變，同時也存在假陰性的可能。DHPLC對外顯子的檢測類型同樣具有選擇性，由于EGFR 20外顯子上游5個-6個位點有特殊堿基雜化而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)干擾峰的存在[38]，限制了此法的應(yīng)用。SARMS是針對已知突變設(shè)計探針，可以檢測權(quán)威研究機構(gòu)得出的29種突變。PCR-SSCP法未檢測到20外顯子T790M相關(guān)耐藥突變。因為缺乏20外顯子的限制性內(nèi)切酶，酶切富集法現(xiàn)階段同樣不能對20外顯子T790M突變進行檢測。PCR-RFLP法具備檢測18-21位點熱點突變的能力。

2.5 操作難易度 直接測序費用高，時間長。TaqMan-MGB實時PCR法操作簡便、快速、靈敏，數(shù)小時內(nèi)即可出結(jié)果。DHPLC法檢測快速、簡便、高通量而且價格便宜。SARMS法通過EGFR突變檢測試劑盒（即EGFR Scorpion Kit；DxS Ltd.Manchester，英國），檢測起來方便快捷。國內(nèi)廠家采用英國DxS公司的蝎子引物法的技術(shù)平臺，通過技術(shù)革新，建立了ADx特異擴增技術(shù)即環(huán)狀特異引物+雙環(huán)探針技術(shù)，并將其商品化為ADxTM EGFR基因突變檢測試劑盒，在靈敏度（檢測能力）、檢測突變位點數(shù)上都和英國的DxS Ltd.Manchester試劑盒保持了完全一致，但在試劑操作上國產(chǎn)試劑盒采用一步加樣遠(yuǎn)比進口的預(yù)混分裝方便快捷（數(shù)據(jù)來源于上海胸科醫(yī)院09年11月結(jié)果）。PCR-SSCP法電泳時間較長，操作步驟比較繁瑣，并且只能進行定性分析，操作時間比較長。酶切富集法步驟較繁瑣，適于實驗室研究，不適于臨床檢測。PCR-RFLP法相對其它方法所需儀器設(shè)備比較簡單，花費較少。

3 小結(jié)與展望

通過對上述方法的詳細(xì)分析，從檢測樣本角度看，當(dāng)取得腫瘤組織時，直接測序法依然是當(dāng)前EGFR突變檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[8,9]。但由于其靈敏度低（只能檢測到30%突變拷貝數(shù)）[33,34]，所以當(dāng)沒有獲取組織樣本時，不推薦使用PCR-直接測序法進行EGFR突變檢測。PCR-TaqMan法、DHPLC法、SARMS法、PCR-SSCP法、酶切富集PCR法，PCR-RFLP法在腫瘤組織中的檢測結(jié)果和直接測序法都保持了較高的一致性，其中SARMS法、DHPLC法、PCR-SSCP法在一定程度上比直接測序法更加敏感。

外周血檢測因其創(chuàng)傷小、操作簡便，容易獲取，正成為近幾年研究的熱點。研究[39]結(jié)果表明血漿游離DNA主要來自凋亡壞死的癌細(xì)胞，其遺傳特性與腫瘤細(xì)胞基因組DNA相同，腫瘤患者血漿中存在大量游離DNA，含量約為健康人的10倍以上。但外周血標(biāo)本的獲取時間窗、獲取后的貯存時間[40]、檢測方法的選擇以及腫瘤組織的異質(zhì)性等依然是影響其與腫瘤組織標(biāo)本突變情況的重要因素。

上述方法中PCR-TaqMan法、DHPLC法、SARMS法、酶切富集法PCR法均有對外周血檢測的報道，DHPLC法、SARMS法和酶切富集法PCR法被用于比較配對腫瘤組織和外周血樣本EGFR突變研究，結(jié)果三種方法在兩種標(biāo)本中的陽性一致率均達(dá)到70%以上。

敏感性上SARMS法、酶切富集法PCR法、PCR-RFLP法都可以達(dá)到1%，而且SARMS法以及PCR-RFLP法的檢測范圍也可以同直接測序法在一定程度上相媲美。操作上以試劑盒最為方便快捷，同時適于推廣到臨床。

獲得組織的情況下直接測序法為首選，同時可采用敏感性較高的SARMS法（ADxTM）或酶切富集PCR法以及PCR-RFLP法進行對比，進一步確定上述方法的敏感性和精確度。若對20外顯子有突變檢測要求時，只能采用SARMS（ADxTM）法或PCR-RFLP法進行比較。若脫離實驗室在臨床檢測時只能選擇SARMS法（ADxTM），但國產(chǎn)ADxTM操作起來更加方便，結(jié)果判定較為簡便，用起來也更加經(jīng)濟。針對晚期不能手術(shù)的NSCLC患者的組織標(biāo)本很難獲得的現(xiàn)狀，當(dāng)?shù)貌坏浇M織樣本時，直接測序法被排除?？晒┻x擇的靈敏度高的方法有PCR-TaqMan法、DHPLC法、SARMS法（ADxTM）、酶切富集PCR法。同組織標(biāo)本選擇條件相似，若對20外顯子有突變檢測要求時只能采用SARMS（ADxTM），若脫離實驗室時選擇方法同組織樣本。

PCR-SSCP法、PCR-RFLP法目前只有組織標(biāo)本的相關(guān)研究，還需要臨床其它肺癌樣本研究的對照和支持。PNA-LNA以及LightCycle-PCR法因為臨床檢測EGFR突變研究較少，仍需進一步研究。

EGFR突變檢測方法的研究會隨著EGFR突變位點的不斷深入研究而完善，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床實際情況，有目的地開展上述方法的大規(guī)模多中心的臨床試驗，為臨床提供方便快捷篩選EGFR-TKI優(yōu)勢患者的方法具有重要的意義。