肺癌基因治療現(xiàn)狀與展望

祖玲玲 劉紅雨 綜述 陳軍 周清華 審校

作者單位：300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境實(shí)驗(yàn)室（通訊作者：陳軍，E-mail:huntercj2004@yahoo.com；周清華，E-mail: zhouqh1016@yahoo.com.cn）

肺癌是當(dāng)今發(fā)生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，根據(jù)病理和臨床特征，可以分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩大類[1]。其中SCLC約占肺癌發(fā)病總數(shù)的16.8%，而NSCLC約占80.4%[2]。由于肺癌被診斷發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已屬晚期，導(dǎo)致患者的5年生存率往往低于10%；隨著肺癌診斷和治療技術(shù)的進(jìn)步，目前肺癌的5年生存率可提高到近15%，但距離理想的治療效果還有一定的差距[3]。常規(guī)肺癌治療多以手術(shù)結(jié)合放化療為主，我國(guó)還聯(lián)合中醫(yī)中藥進(jìn)行綜合治療。由于目前肺癌治療普遍缺乏針對(duì)患者的特異性，往往容易產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用。近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，使得針對(duì)腫瘤的基因診斷、靶向治療、基因治療逐漸成為可能，這也就為肺癌的治療開辟了更加廣闊的前景。

基因治療（gene therapy）是通過分子生物學(xué)技術(shù)，將目的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，糾正患者細(xì)胞錯(cuò)誤的基因表達(dá)，從而使疾病得以治療，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合而誕生的新興臨床醫(yī)療技術(shù)。基因治療主要用于治療危害人類健康的十分嚴(yán)重的疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[4]。作為疾病治療的新手段，基因治療已有一些成功的應(yīng)用，并逐步向主流醫(yī)療發(fā)展；基因治療作為一種特異性強(qiáng)、靶向性好的新型臨床治療方法，越來(lái)越被廣大的肺癌醫(yī)學(xué)者所重視[5]。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)肺癌發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，出開展了越來(lái)越多的有關(guān)肺癌的基因治療的實(shí)驗(yàn)研究甚至臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。本文將對(duì)肺癌的基因治療的目的原則、治療方法、載體選擇進(jìn)行綜述總結(jié)，并展望其可能的前景。

1 肺癌基因治療的目的原則

肺癌的產(chǎn)生是一個(gè)多基因參與、逐步發(fā)展的復(fù)雜過程，其中包括原癌基因的活化、抑癌基因的失活、microRNA表達(dá)譜的改變等諸多方面。隨著肺癌基礎(chǔ)研究的開展，尤其是近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄本組學(xué)、microRNA表達(dá)譜的廣泛應(yīng)用，使對(duì)肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程的了解更加全面深入。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中基因表達(dá)具有一定的特點(diǎn)，例如：凋亡抑制蛋白（inhibotor of apoptosis protein, IAP）過量表達(dá)[6]、抑癌基因p53的突變或缺失[7]、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達(dá)水平增高[8]、microRNA let-7家族表達(dá)水平下調(diào)[9]、microRNA miR-17-92表達(dá)增加[10]等?；蛑委熤饕苯俞槍?duì)這些基因表達(dá)的變化進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過分子生物學(xué)的手段，抑制癌基因、相關(guān)細(xì)胞因子或microRNA的過度表達(dá)，補(bǔ)償抑癌基因或相關(guān)microRNA的表達(dá)，以達(dá)到限制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)識(shí)別清除腫瘤細(xì)胞，最終達(dá)到對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。肺癌基因治療的目的原則包括抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和殺死肺癌細(xì)胞。

2 肺癌基因治療方法

圍繞上述肺癌基因治療的目的原則，針對(duì)肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等各個(gè)階段以及治療靶位的不同，基因療法可以概括為以下幾種類型：

2.1 阻礙原癌基因過量表達(dá)治療 原癌基因的突變激活是肺癌發(fā)生的充分條件，原癌基因或其啟動(dòng)子的突變可導(dǎo)致原癌基因的高水平表達(dá)，最終導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的永生化和惡性生長(zhǎng)。針對(duì)原癌基因的異常活化，設(shè)計(jì)特異的反義RNA或siRNA進(jìn)行RNA干擾，可以有效地阻礙原癌基因的過量表達(dá)。目前常用的RNA干擾的靶基因包括：myc、neu、ras等。目前已報(bào)道，將抑制c-Myc基因的miRNA-45表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ras基因異常表達(dá)的NSCLC細(xì)胞中，可以抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]；myc基因的反義RNA體外實(shí)驗(yàn)可以抑制SCLC細(xì)胞的惡性生長(zhǎng)[12]。阻礙原癌基因的過量表達(dá)治療，可以抑制肺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，但不能殺死腫瘤細(xì)胞。

2.2 補(bǔ)償抑癌基因表達(dá)治療 補(bǔ)償抑癌基因表達(dá)治療的方法，是利用分子生物學(xué)的技術(shù)，將正常的抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞中，替代原有的突變失活的抑癌基因，或者干擾因抑癌基因的突變?cè)斐傻男盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失調(diào)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。目前常用的抑癌基因包括：p53、p16、RB等；其中又以p53基因應(yīng)用最廣，目前已有針對(duì)NSCLC治療攜帶p53基因的重組腺病毒載體的I期臨床實(shí)驗(yàn)[13]，相關(guān)的治療效果和毒副作用需進(jìn)一步的總結(jié)。p53基因過表達(dá)治療主要針對(duì)p53基因缺陷的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)無(wú)此突變的細(xì)胞無(wú)效。抑癌基因表達(dá)治療配合放化療，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞敏感性的聯(lián)合治療，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段[14,15]。

2.3 抗血管生成基因治療 與其它實(shí)體腫瘤相同，肺癌是血管依賴性腫瘤，腫瘤血管為腫瘤的生長(zhǎng)提供氧氣和養(yǎng)分的輸送和代謝廢物的輸出，此外腫瘤血管通常缺乏平滑肌，基底膜有不規(guī)則的漏洞，有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移?？寡苌苫蛑委熤饕ㄟ^抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前抗血管生成基因治療主要包括：針對(duì)VEGF及其受體（VEGFR）的基因治療、血管抑素（vasostatin）基因治療、內(nèi)皮抑素（endostatin）基因治療[16]。其中又以VEGF誘導(dǎo)腫瘤血管生成作用最強(qiáng)、特異性最高，為抗血管生成基因治療的首選[17]。

2.4 自殺基因治療 針對(duì)腫瘤治療的自殺基因治療方法，是通過將表達(dá)外源性酶活性的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，隨后在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的活性酶可以將腫瘤細(xì)胞周圍的無(wú)毒性的藥物（稱為藥物前體）催化成為僅對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的藥物，從而達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[18]。由于在實(shí)際應(yīng)用中，通常采用病毒載體，因此又被稱為病毒介導(dǎo)的酶解藥物前體療法（virus directed enzyme prodrug therapy, VDEPT）。自殺基因治療系統(tǒng)有數(shù)十種，其中在肺癌研究中運(yùn)用最多的是胸腺嘧啶激酶基因/丙氧鳥苷系統(tǒng)（TK/GCV）和胞苷脫氨酶/5-氟胞嘧啶系統(tǒng)（CD/5-FC）。除了針對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療，目前已經(jīng)出現(xiàn)應(yīng)用TK/GCV系統(tǒng)且以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行治療的嘗試[19]。但自殺基因治療僅能殺傷S期細(xì)胞，自殺基因的靶向?qū)雴栴}是該療法的主要限制因素。

2.5 免疫基因治療 肺癌細(xì)胞的免疫原性弱，一般不足以刺激免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生排斥反應(yīng)[20]。免疫基因治療就是將特定外源基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中，使其高水平表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞因子或MHC抗原，從而激化抗腫瘤的特異性免疫作用。使用遺傳工程技術(shù)處理腫瘤細(xì)胞，使其攜帶特定細(xì)胞因子基因，注射至機(jī)體后可以在腫瘤位點(diǎn)持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)并釋放所攜帶的細(xì)胞因子。注射活的攜帶特定細(xì)胞因子基因的腫瘤細(xì)胞，經(jīng)過增殖會(huì)產(chǎn)生更多的抗原并提高細(xì)胞因子濃度，直到達(dá)到生物學(xué)和藥理學(xué)所需的閾值，引起抗腫瘤的特異性免疫反應(yīng)。隨著免疫反應(yīng)的進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞被殺死，從而關(guān)閉了初始的觸發(fā)作用[21]。目前研究常用的細(xì)胞因子包括：提高IL-2、INF-γ、TNF-α等從而提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別作用，增強(qiáng)組織相容性抗原等位基因表達(dá)，誘導(dǎo)機(jī)體的免疫反應(yīng)。免疫基因治療具有結(jié)合機(jī)體免疫的特點(diǎn)，正逐漸成為肺癌基因治療的研究熱點(diǎn)之一[22]。

3 肺癌基因治療的載體選擇

肺癌基因治療成功的關(guān)鍵之一在于外源基因在目的細(xì)胞中的高效穩(wěn)定表達(dá)，即基因治療的靶向性、高效性和穩(wěn)定性，很大程度上取決于基因治療的載體系統(tǒng)。好的基因治療載體具備靶向性、無(wú)毒副作用、不引起炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。目前所使用的載體系統(tǒng)有十余種，從大的方面可以分為病毒載體和非病毒載體兩大類。由于病毒載體較非病毒載體轉(zhuǎn)移效率高，在實(shí)際方案中病毒載體占到85%。另一方面，由于病毒載體在安全性、免疫原性方面的局限性，使得越來(lái)越多的新興非病毒載體研究得到發(fā)展。下面對(duì)肺癌基因治療的主要載體進(jìn)行小結(jié)。

3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于RNA病毒家族成員，基因組由兩個(gè)正義的單鏈RNA分子組成，被衣殼蛋白包裹。整合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合于衣殼蛋白上。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組由兩端長(zhǎng)末端重復(fù)序列、gag、pol、env四部分組成，其中長(zhǎng)末端序列起始雙鏈DNA的合成，gag編碼衣殼蛋白，pol編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶，env編碼受體識(shí)別及衣殼錨定的蛋白。外源目的基因替換gag、pol、env基因后，逆轉(zhuǎn)錄病毒不能完成自身復(fù)制，但可以將攜帶的外源目的基因穩(wěn)定地整合入靶細(xì)胞DNA序列中[23]。針對(duì)這一特性，逆轉(zhuǎn)錄病毒可用于作為基因治療的載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前研究最為深入、應(yīng)用最早、使用最為廣泛的基因治療載體成員之一。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠非常有效地整合進(jìn)入靶細(xì)胞的基因組中，并持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)外源基因，同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染增殖細(xì)胞，因此比較適于腫瘤的基因治療。目前已有使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因治療案例，通過抑制腫瘤的血管生成抑制腫瘤的生長(zhǎng)[24]。但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在特異性低、容量較小、病毒滴度較低、不能滿足體積較大腫瘤的治療要求等缺點(diǎn)，使其在腫瘤基因治療中存在一定的局限性。近年來(lái)新型靶向性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其包裝細(xì)胞系的構(gòu)建逐漸克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體特異性低的缺陷[25]，使得逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在腫瘤基因治療中日趨完善。

3.2 腺病毒載體 腺病毒屬于雙鏈DNA病毒成員，基因組有36 kb。依據(jù)病毒復(fù)制中基因表達(dá)的時(shí)間順序，腺病毒載體基因組被分成兩個(gè)主要部分：早期和晚期。早期表達(dá)基因包括四個(gè)部分，分別命名為E1、E2、E3、E4。晚期表達(dá)基因含有五個(gè)編碼單元，分別是L1、L2、L3、L4和L5。敲除E1后腺病毒無(wú)法復(fù)制，因此無(wú)E1的重組腺病毒載體屬于復(fù)制缺陷型腺病毒載體[26]。外源目的基因整合到載體E1區(qū)域可穩(wěn)定表達(dá)。E3和E4的敲除允許大的外源基因插入載體，并減弱病毒的免疫原性。此外，腺病毒載體同時(shí)具備其它的特點(diǎn)，包括：相對(duì)于其它病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高；可以感染分裂和非分裂的細(xì)胞；病毒滴度較高；不整合入染色體，安全性較高；持續(xù)表達(dá)能力不強(qiáng)且表達(dá)周期短。應(yīng)用于肺癌基因治療，由于腺病毒感染具有親肺性，使得腺病毒載體在肺內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率更高，使其成為肺癌基因治療最常用的病毒載體[14]。目前已研制出多種重組的腺病毒載體，克服了傳統(tǒng)腺病毒載體易激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的缺點(diǎn)[27]。

3.3 腺病毒相關(guān)病毒載體 腺病毒相關(guān)病毒載體與腺病毒載體的特性極為相似，優(yōu)點(diǎn)是可以感染分裂和非分裂的細(xì)胞且并不引起免疫反應(yīng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，安全性好，易于基因操作，易制備高滴度病毒，可利用放射線將病毒從潛伏感染進(jìn)入裂解感染，為基因治療聯(lián)合放療創(chuàng)造條件；與腺病毒載體不同的是，腺病毒相關(guān)病毒載體能夠?qū)⑺鶖y帶的外源基因整合入宿主基因組特異的位置，從而可以長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。缺點(diǎn)是載體容量有限，可能會(huì)出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)等。隨著腺病毒相關(guān)病毒新型復(fù)制模型的發(fā)展，將有更多腺病毒相關(guān)病毒載體的基因治療應(yīng)用于肺癌治療[25]。

3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽載體 HIV的Tat蛋白、HSV的VP22蛋白、HBV的前S抗原等蛋白可穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，這主要由于該類蛋白中的特殊結(jié)構(gòu)域（一般為10個(gè)-30個(gè)氨基酸）發(fā)揮作用。將這些結(jié)構(gòu)域與其它蛋白、多肽或寡核苷酸等化合物結(jié)合或融合表達(dá)，可以將生物大分子帶入細(xì)胞，這些具有攜帶生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽統(tǒng)稱為細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)肽。目前已成功構(gòu)建利用Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的策略，稱為Tat-Phage系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)性進(jìn)行基因治療[28]。

3.5 殼聚糖載體 殼聚糖來(lái)源于甲殼類動(dòng)物中甲殼質(zhì)進(jìn)行脫乙?；蟮玫降亩嗵俏镔|(zhì)，屬于天然陽(yáng)離子聚合物。殼聚糖無(wú)毒副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性。殼聚糖可以與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，抵抗血清的降解作用，進(jìn)入細(xì)胞在體內(nèi)表達(dá)報(bào)告基因，但基因表達(dá)時(shí)間較遲[29]。殼聚糖作為基因治療載體的優(yōu)勢(shì)為安全無(wú)毒，故殼聚糖及其衍生物已經(jīng)開診在肺癌中的基礎(chǔ)研究。

3.6 陽(yáng)離子脂質(zhì)體載體 脂質(zhì)體易于制備，具有較高的生物相容性并可以搭載多種藥物，陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶有正電荷，易于與帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜相結(jié)合，提高轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)表明，陽(yáng)離子脂質(zhì)體通過靜脈注射給藥、經(jīng)皮給藥以及氣管內(nèi)給藥均可以獲得較高的轉(zhuǎn)染效率并且明顯集中于肺部。陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的mda-7/IL-24基因在體內(nèi)肺部腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性基因治療已經(jīng)進(jìn)行[30]。

3.7 納米顆粒載體 納米顆粒載體屬于一種新型的聚合體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。納米顆粒體積小，更易于將攜帶的目的基因擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。已有基于納米顆粒載體基因治療應(yīng)用于小鼠癌癥模型實(shí)驗(yàn)證明有較好的抑癌效果。然而，基于納米顆粒的載體基因治療可能受限于載體容量，而小容量的納米顆粒載體可以作為siRNA的有效載體。

4 肺癌基因治療前景展望

肺癌的基因治療總體上還處于起步階段，大部分還處于初創(chuàng)或臨床I期實(shí)驗(yàn)階段，成功應(yīng)用于臨床尚需大量的工作。目前還存在缺少高效傳遞系統(tǒng)、缺少穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)以及易產(chǎn)生宿主免疫反應(yīng)等諸多問題。但有理由相信，隨著基礎(chǔ)研究的深入，將出現(xiàn)更多的、更為有效的基因治療靶位和治療方式；隨著大量臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，將會(huì)出現(xiàn)較為固定和常規(guī)的基因治療模式和方法，成為可供醫(yī)生選擇的治療手段。由基因治療自身的靶向性好、可操控等特點(diǎn)，可以預(yù)見其將有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)隨著基因診斷等其它新興技術(shù)的臨床應(yīng)用的普及，將最終實(shí)現(xiàn)肺癌患者的基因組水平的個(gè)性化診斷。根據(jù)診斷結(jié)果，將可以實(shí)現(xiàn)肺癌的個(gè)性化、多靶位的基因治療，完成對(duì)患者手術(shù)前肺癌的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移控制，術(shù)后恢復(fù)期的持續(xù)治療最終將大大提高肺癌患者的5年存活率?；蛑委煴貙⒊蔀榉伟┲委煹闹匾ぞ?，最終將造福廣大肺癌患者。