MicroRNA在肺癌診斷和治療方面的研究進展

王 鶴（綜述），王朝霞（審校）

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京 210011

MicroRNA（簡稱miRNA）是非編碼小RNA家族的成員之一，長度為18～25個堿基，通過堿基互補原理結(jié)合到靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)（3'UTR），抑制mRNA的翻譯或誘導(dǎo)其降解從而改變靶蛋白的表達水平。

1 miRNA的發(fā)現(xiàn)

miRNA在許多腫瘤中存在異常表達或突變現(xiàn)象，它們可能起到原癌基因和抑癌基因的作用，可以為腫瘤的診斷和生物治療提供新的靶標。1993年，Lee等[1]首先在秀麗新小桿線蟲發(fā)現(xiàn)miRNA這一家族的第一個成員lin-4。lin-14基因的突變使得線蟲能夠蛻皮，但只能停留在L1階段，不能發(fā)育為成蟲。lin-14編碼一個核內(nèi)蛋白，負責(zé)幼蟲從L1階段到L2階段的細胞分裂。lin-4通過堿基配對的方式結(jié)合到靶基因lin-14的mRNA的3'UTR，抑制lin-14的翻譯。2000年Reinhart等[2]發(fā)現(xiàn)了另一個類似的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA：let-7。隨后，在多種生物物種中鑒別出上千種miRNAs。

2 miRNA的生物合成和功能

miRNA體內(nèi)的形成過程大致如下：在細胞核內(nèi)，首先由聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄合成pri-miRNA，由RNaseⅢ內(nèi)切酶Drosha剪切得到約70個核苷酸的莖環(huán)型中間物premiRNA，在Ran-GTP和運輸受體Exportin-5的共同作用下，pre-miRNA出核轉(zhuǎn)運到胞漿，由另一種RNaseⅢ內(nèi)切酶Dicer剪切加工，將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA加工為雙螺旋結(jié)構(gòu)miRNA-miRNA。雙鏈解開后，成熟的單鏈miRNA隨后進入RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA induced silencing complex，RISC）中。單鏈miRNA與RISC結(jié)合形成miRNP復(fù)合體后，miRNA通過與靶基因的3′UTR區(qū)互補配對，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對靶基因mRNA進行切割或者翻譯抑制從而在轉(zhuǎn)錄后沉默基因，并通過細胞內(nèi)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)狀調(diào)控體系，對生物體的發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫調(diào)控等生理活動進行精確調(diào)節(jié)。

3 miRNA與腫瘤的關(guān)系

miRNA在許多腫瘤中存在異常表達或突變現(xiàn)象，推測它們可能起到原癌基因和抑癌基因的作用。且有研究表明，50%以上的miRNA定位在腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域，包括LOH區(qū)、染色體擴增區(qū)及脆性位點等。通過對人肺癌、乳腺癌、胃腸癌、胰腺癌、肝癌等腫瘤組織miRNA表達譜的分析，發(fā)現(xiàn)每一種腫瘤都有眾多特定的miRNA表達相對于正常組織發(fā)生變化，讓越來越多的科研人員將研究重點轉(zhuǎn)移到miRNA與腫瘤發(fā)生的密切關(guān)系上。

4 miRNA在肺癌診斷中的作用

肺癌是癌癥相關(guān)性死亡的頭號殺手，總的5年生存率不到15%，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌病例的80%以上，由于大多數(shù)患者在患病早期沒有明顯的癥狀，確診時多已進入中晚期階段，治療效果及預(yù)后較差。但研究顯示Ⅰ期NSCLC患者術(shù)后5年生存率達到83%，所以早發(fā)現(xiàn)，早診斷仍是肺癌治療的關(guān)鍵。miRNA的表達具有時空特異性。在不同組織、不同發(fā)育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性。miRNA的表達譜，不僅指miRNA的種類，也指各種miRNA的豐度，直接反映了細胞組織的分化發(fā)育狀態(tài)。miRNA在不同腫瘤中具有特定的表達模式，這為腫瘤的基因診斷提供了一種新方法。

Jiang等[3]在52例非小細胞肺癌病例中發(fā)現(xiàn)has-miR-125a-3p和has-miR-125a-5p（分別位于pre-miR-125a的3′端和5′端的兩種成熟MicroRNA）在癌組織中均比周圍正常組織表達低。本課題組利用miRNA芯片技術(shù)，獲得了NSCLC的miRNA表達圖譜，并通過熒光實時定量PCR鑒定了40個差異表達的miRNAs[4]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比較，在非小細胞肺癌組織中miR-451表達顯著降低。Yu等[5]利用RT-PCR分析 112例非小細胞肺癌患者組織 miR-21、let-7a、miR-137、miR-182和miR-372的表達情況，發(fā)現(xiàn)可以利用這些microRNA的綜合表達情況來對患者進行診斷。

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，SNP自身的特性決定了它在遺傳性疾病研究中具有重要意義。Tian等[6]在中國1058例肺癌患者和1035例正常對照組檢測miR-196a2 SNP rs11614913發(fā)現(xiàn)，突變型純合子CC較雜合子TC及野生型純合子TT的肺癌易感性提高了約25%。Chin等[7]發(fā)現(xiàn)在每年吸煙少于40包的非小細胞肺癌患者中，miR-let-7與其靶基因KRAS的3′UTR的完全匹配區(qū)的第6位點（LCS6）等位基因突變率為18.1%～20.3%，而正常人僅為5.8%；另外，體外研究發(fā)現(xiàn)LCS6發(fā)生突變的miR-let-7，相應(yīng)地出現(xiàn)KRAS表達增高，提示miR-let-7 LCS6突變可以作為此類非小細胞肺癌診斷的易感指標。Xiong等[8]對666例小細胞肺癌與758例正常對照組比較發(fā)現(xiàn)，miR-18273′UTR的rs3134615的基因型與小細胞肺癌的易感性相關(guān)，相對于GG基因型，GT、TT基因型的優(yōu)勢比為2.08。

隨著肺癌生物靶向治療的發(fā)展，對于非小細胞肺癌的精確分型顯得尤為重要。對122例非小細胞肺癌標本（62例鱗癌，60例腺癌）進行表達譜分析及qRT-PCR驗證的方法發(fā)現(xiàn)has-miR-205在非小細胞肺癌的腺、鱗癌分型中，對鱗癌的敏感性達96%，特異性達90%[9]。Raponi等[10]運用交叉驗證分析，證明了miR-146b診斷鱗癌具有很高的精確性。Yu等[11]對肺腺癌痰液的miRNA表達譜分析及驗證發(fā)現(xiàn)，miR-21、miR-486、miR-375、miR-200b對于區(qū)分肺腺癌與正常人的敏感性及特異性分別達到80.6%、91.7%。

外周血液循環(huán)中miRNA表達譜的變化作為有前景的診斷工具已經(jīng)越來越受到人們的關(guān)注。Heegaard等[12]對220例早期非小細胞肺癌與對應(yīng)的正常組的血清及血漿miRNA檢測發(fā)現(xiàn)， 血清中 miR-146b、miR-221、let-7a、miR-155、miR-17-5p、miR-27a和 miR-106a較正常組表達顯著下降而miR-29c顯著增高；血漿中miR-let7b與不良預(yù)后存在密切關(guān)系，miR-223特異性表達于NSCLC IA/B期。對肺癌不同時期的904個血清miRNA分析發(fā)現(xiàn)，伴隨肺癌的發(fā)生發(fā)展，存在不同時期的特異miRNA譜。對400例NSCLC患者與220例正常對照組血清miRNA進行qRT-PCR及危險評分提示，10個血清miRNA可高特異性、高敏感性診斷早期非小細胞肺癌[13]。Foss等[14]發(fā)現(xiàn) miR-1254、miR-574-5P 作為早期肺癌的診斷指標，敏感性與特異性分別達82%、77%。

5 miRNA在肺癌治療中的作用

生物體通過多層次、精確的內(nèi)部調(diào)節(jié)機制，完成發(fā)育、分化、代謝等各項正常的生理活動。一旦這些調(diào)控系統(tǒng)出現(xiàn)紊亂，細胞失去對分化、增殖、凋亡等過程正確及時的調(diào)控，正常的組織形態(tài)就會出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。miRNA作為原癌基因或抑癌基因，參與上述過程的調(diào)控，與腫瘤的靶向生物治療存在密切關(guān)系。

5.1 與增殖相關(guān)的miRNA與肺癌治療

在香港女性中，非吸煙肺腺癌患者中70%的患者存在EGFR突變。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染has-miR-145可抑制存在EGFR突變的肺腺癌細胞株HCC4006、NCI-H1975、NCI-H1734的增殖。miR-192通過調(diào)控靶基因RB1可增強肺癌細胞增殖[15]。miR-182通過靶作用于CTTN能抑制A549肺癌細胞株增殖[16]。miR-145可通過下調(diào)EGFR、NUDT1和c-myc的表達抑制肺癌細胞增殖[17-19]。 miR-93、miR-98、miR-197 通過下調(diào)抑癌基因FUS1的表達而起到抑制肺癌生長、發(fā)展的作用且與肺癌患者總體生存率密切相關(guān)。miR-let-7a可通過靶作用于NIRF上調(diào)P21WAF1的表達而抑制肺腺癌A549細胞增殖。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，miR-let-7a通過抑制KRAS和c-myc的表達來抑制裸鼠肺癌生長[19]。

5.2 與細胞周期相關(guān)的miRNA與肺癌治療

Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，肺癌中在細胞水平過表達miR-126通過靶作用VEGF使A549、Y-90與SPC-A1等細胞株細胞周期停滯在G1期，抑制腫瘤細胞的生長；在活體水平，慢病毒轉(zhuǎn)染miR-126的A549細胞株接種的裸鼠體重較對照組下降22.4%。Bandi等[21]發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌中，生理濃度的miR-15a、miR-16以 Rb依賴的方式靶作用于 CCND1，CCND2，CCNE1而使細胞周期停滯在G1期。另一項研究[22]顯示miR-107、miR-185同樣具有使細胞周期停滯在G1期的能力，尤其是miR-107；PCR及免疫印跡的方法證實CDK6為miR-107、miR-185 靶基因。 下調(diào) miR-21、miR-16、miR-181a表達使A549細胞株細胞周期停滯在S期從而抑制其生長。

5.3 與凋亡相關(guān)的miRNA與肺癌治療

Liu等[23]發(fā)現(xiàn)過表達的miR-494下調(diào)anti-BPDE誘導(dǎo)的肺癌細胞株16HBE中PTEN的表達；過表達的miR-494抑制caspase3/7的活力，而低表達miR-494則可降低肺癌細胞的惡性程度。Crawford等[24]通過表達譜分析發(fā)現(xiàn)肺癌與肺癌周圍正常組織比較，miR-133B下調(diào)程度最大 （28.62倍）；通過熒光素酶報告實驗證實miR-133B的下游靶基因為MCL-1、BCL2L2/BCL-W（兩者均為BCL-2家族抗凋亡蛋白）。過表達miR-133B沉默MCL-1和BCL2L2的表達聯(lián)合吉西他濱（非小細胞肺癌一線化療藥物且可通過BCL-2家族誘導(dǎo)凋亡）可誘導(dǎo)肺癌細胞株H2009的凋亡。另一項研究發(fā)現(xiàn)[25]，無論是否吸煙、EGFR是否突變（突變型對EGFR-TKI敏感），低表達miR-21聯(lián)合EGFR-TKI都可誘導(dǎo)肺癌細胞的凋亡，提示miR-21可能成為肺癌靶向治療的有效靶點。過表達miR-192通過靶作用于RB1，激活caspase-7、PARP誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡[15]。

5.4 與耐藥相關(guān)的miRNA與肺癌治療

近年來，腫瘤耐藥的問題逐漸成為人們關(guān)注的熱點。PC9/AB11細胞株（起源于PC9細胞株的耐吉西他濱肺腺癌細胞株）與PC9細胞株比較發(fā)現(xiàn)，兩者的細胞倍增時間、細胞周期分布、半數(shù)抑制濃度（IC50）存在顯著性差異；miRNA表達譜分析比較發(fā)現(xiàn)miRNA同樣存在差異性表達[26]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中過表達miR-135a可導(dǎo)致紫杉醇耐藥，部分通過下調(diào)APC實現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-451通過AKT通路作用可使肺癌細胞株A549對順鉑（cisplatin，DDP）的敏感性增加[27]。 Garofalo等[28]發(fā)現(xiàn)，在肺癌中，miR-221/222通過抑制靶基因PTEN和TIMP3的表達導(dǎo)致TRAIL耐藥。上調(diào)miR-7的表達可通過下調(diào)EGFR通路蛋白的表達，增強喉鱗癌細胞株SQ20B、乳腺癌細胞株MDA-MD-468、肺癌細胞株A549、惡性膠質(zhì)瘤細胞株U251和U87的放療敏感性；相反下調(diào)miR-7的表達可通過上調(diào)EGFR及其下游分子的表達，降低惡性膠質(zhì)瘤細胞株U251的放療敏感性[29]。受LIN28B調(diào)控的miR-let-7g通過下調(diào)KRAS可增強肺癌對電離輻射的敏感性。

5.5 與侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA與肺癌治療

肺癌治療的一大難點就是難以防治肺癌全身多處轉(zhuǎn)移。對肺正常組織、肺癌組織、肺正常支氣管上皮細胞株、肺癌細胞株的miR-206的real time PCR發(fā)現(xiàn)，miR-206的表達與肺癌的侵襲性呈負相關(guān)[30]。miR-328、miR-330-3P可用于鑒別非小細胞肺癌是否發(fā)生腦轉(zhuǎn)移；而且，miR-328部分通過上調(diào)PRKCA表達使非小細胞肺癌具有侵襲、轉(zhuǎn)移能力[31]。Garofalo等[28]發(fā)現(xiàn)，miR-200通過抑制EMT過程從而抑制肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移。miR-221/222通過靶作用于PTEN和TIMP3，誘導(dǎo)肺癌轉(zhuǎn)移。miR-182通過靶作用CTTN抑制肺腺癌A549細胞侵襲[16]。miR-let-7g通過靶作用HMGA2下調(diào)E2F1抑制肺癌細胞株A549轉(zhuǎn)移[32]。miR-125a-5p通過EGFR通路負性調(diào)控肺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

6 小結(jié)

在肺癌領(lǐng)域中miRNA的研究尚處于起步階段，利用miRNA進行肺癌診斷和治療還有許多尚未解決的問題。區(qū)別正常組織與腫瘤組織、有利于腫瘤的分期及分型的特征性miRNA譜有待于進一步研究。miRNA可起抑癌或致癌作用，如何針對致癌miRNA設(shè)計反義分子，進而導(dǎo)入高效特異表達致癌miRNA反義分子及抑癌miRNA并解決免疫排斥等安全性要求是我們需要思考的問題?；A(chǔ)研究中很多miRNA的功能及其靶基因還沒被認識；大多數(shù)研究關(guān)注的是miRNA對靶基因的調(diào)控作用，而忽視了對miRNA基因表達的調(diào)控機制以及不同的miRNA之間是否有相互作用等的研究。筆者相信，隨著上述問題的解決，不久的將來miRNA將會為肺癌的診治帶來革命性的進展。

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