先進生物燃料導向的脂肪酸途徑合成生物學改造

周雍進，趙宗保

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國家實驗室 (籌)，大連 116023

3 中國科學院研究生院，北京 100049

先進生物燃料導向的脂肪酸途徑合成生物學改造

周雍進1,3，趙宗保1,2

1 中國科學院大連化學物理研究所，大連 116023

2 大連潔凈能源國家實驗室 (籌)，大連 116023

3 中國科學院研究生院，北京 100049

化石能源日益枯竭，迫切需要尋找新型燃料。脂肪族生物燃料由于其熱值高、性能好而受到廣泛重視。微生物脂肪酸代謝途徑是生產(chǎn)先進生物燃料的重要途徑。文中綜述了近幾年基于合成生物學理念改造脂肪酸途徑的進展，介紹了合成生物學在微生物柴油、中長鏈脂肪醇、長鏈烴類化合物生物合成中的應(yīng)用，并展望了脂肪族生物燃料的發(fā)展方向。

合成生物學，先進生物燃料，脂肪酸合成，生物柴油

燃料乙醇和生物柴油是當前生物燃料研究的熱點，其生產(chǎn)成本在持續(xù)下降。但是燃料乙醇作為汽油替代品，其水溶性、揮發(fā)性、熱值低等缺點制約著其大規(guī)模使用。先進生物燃料 (Advanced biofuel)是指以高產(chǎn)非糧作物、農(nóng)林廢棄物、其他可持續(xù)性生物質(zhì)或者藻類為原料，通過化學、物理、生物甚至必要的組合技術(shù)，轉(zhuǎn)化獲得的具有與化石燃料相當甚至更高能量密度，易于儲存和運輸?shù)娜剂戏肿覽3]。由于其性能優(yōu)良和可持續(xù)性，先進生物燃料近來受到學術(shù)界和工業(yè)界重視?；谖⑸锎x的生物技術(shù)對設(shè)計和制造先進生物燃料分子具有重要意義[4]。美國加州大學洛杉磯分校學者通過合成生物學手段改造大腸桿菌Escherichia coli氨基酸生物合成途徑，合成了一系列碳鏈稍長的醇類化合物，并且大幅度提高了產(chǎn)量，為生物汽油發(fā)展提供了新思路[5]。生物柴油和石油來源的柴油性質(zhì)相似，如果能進一步降低綜合生產(chǎn)成本，將具有巨大市場潛力。然而，生物柴油當前面臨最重要的瓶頸問題是植物油脂資源非常有限，難以支撐產(chǎn)業(yè)發(fā)展。另外，中長鏈 (碳鏈長度 C10-C18) 燃料如航空煤油目前尚沒有非常有效的途徑獲取生物基替代品。最近關(guān)于微生物脂肪酸生物合成途徑的認識和改造取得了一些成果，拓展了生物燃料的合成路線。

以下綜述了近年來理性改造脂肪酸途徑獲取以脂肪酸代謝衍生物為目標的生物燃料研究，并展望了合成生物學策略在設(shè)計、改造生物燃料代謝途徑中的應(yīng)用。

1 合成生物學概念的內(nèi)涵及其蓬勃發(fā)展

合成生物學一詞早在1911年就出現(xiàn)在法國物理化學家 Stephane Leduc所著“生命的機理 (The Mechnism of Life)”一書中。1980年，Hobom B將其定義為利用重組 DNA技術(shù)對細菌進行基因工程改造[6]。隨著分子系統(tǒng)生物學的發(fā)展，2000年Kool等在美國化學年會上重新提出，定義為基于系統(tǒng)生物學的遺傳工程，從人工堿基DNA分子、基因片段、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與信號傳導路徑到細胞的人工設(shè)計與合成[7]。西方學者對合成生物學比較一致的定義是：利用工程理念理性合成復雜、具有生物意義的不同層次系統(tǒng)—從單個生物分子到整個細胞、組織、器官，而這些合成的生物系統(tǒng)能執(zhí)行自然界所沒有的功能[8]。合成生物學、計算生物學與化學生物學一同構(gòu)成系統(tǒng)生物技術(shù)的方法基礎(chǔ)。

近幾年合成生物學發(fā)展十分迅速，世界上多國政府部門及眾多學者開始關(guān)注合成生物學研究，合成生物學也因此取得了蓬勃發(fā)展，并在天然產(chǎn)物、生物能源等領(lǐng)域取得了令人矚目的成績。比如：美國學者先后在 E. coli和釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae中構(gòu)建了青蒿素前體生物合成途徑[9-10]，并進行代謝工程優(yōu)化，在 S. cerevisiae中獲得149 mg/L的青蒿酸[10]，有望降低青蒿素生產(chǎn)成本，為非洲貧窮瘧疾患者帶來了希望。為了獲得性能更好的汽油替代品，在 E. coli中引入 2-酮酸脫羧酶(KDC) 和乙醇脫氫酶 (ADH) 對氨基酸生物合成途徑進行改造，構(gòu)建了異源的醇類生物合成途徑，合成了一系列碳鏈長度 (C3-C8) 醇類生物燃料，其中異丁醇產(chǎn)量最高達到22 g/L[5,11]。為了增加抗癌藥物紫杉醇產(chǎn)量，降低其生產(chǎn)成本，在E. coli中構(gòu)建紫杉醇前體生物合成途徑，通過模塊優(yōu)化策略優(yōu)化生物合成途徑，其紫杉二烯產(chǎn)量達到1.0 g/L，5-羥基紫杉二烯產(chǎn)量達到 60 mg/L[12]。最引人注目的成果當屬2010年Venter研究所成功地將人工合成的蕈狀支原體 Mycoplasma mycoides基因組轉(zhuǎn)入到山羊支原體Mycoplasma capricolum宿主細胞中，獲得了具有生存和自我復制能力的新菌株[13]。

合成生物學的蓬勃發(fā)展使人們對微生物理性改造有了更深入的認識，也給現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)提供了更有效的工具。近年來，生物燃料研究也充分利用了合成生物學最新發(fā)展理念，加速了其自身發(fā)展。除了上述利用合成生物學成功生產(chǎn)汽油替代品(C3-C8醇類) 外，人們開始利用合成生物學策略改造脂肪酸途徑合成能量密度更高，性能更好的中長鏈生物燃料。

2 合成生物學改造脂肪酸途徑合成生物燃料

模式微生物E. coli、S. cerevisiae等由于其遺傳背景清楚，遺傳操作手段成熟，被廣泛用作合成生物學研究宿主。而脂肪生物合成能力較強的產(chǎn)油微生物遺傳背景認識非常有限，尚難以進行合成生物學改造。目前脂肪族生物燃料的研究主要集中在E. coli中。

2.1 E. coli脂肪酸代謝途徑

E. coli脂肪酸合成途徑及其調(diào)控機制已得到廣泛研究。如圖1所示，乙酰-CoA經(jīng)羧化得到丙二單酰-CoA后，經(jīng)脂肪酸合成酶合成脂酰-ACP，隨后經(jīng)硫酯酶催化合成脂肪酸。在E. coli中，大部分脂酰-ACP經(jīng)過甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移到甘油衍生物合成磷脂，少量的合成類脂等物質(zhì)。當脂肪酸在E. coli中過量積累時，被快速轉(zhuǎn)化為脂酰-CoA，然后經(jīng)過β氧化途徑分解成乙酰-CoA。E. coli脂肪酸生物合成途徑受一系列機制嚴格調(diào)控，脂肪酸調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄嚴格受到FadR和FabR調(diào)控，乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合成途徑的FabH (3-酮酰-ACP合成酶III) 和FabI (烯酰ACP還原酶) 受到長鏈脂酰-ACP反饋抑制[14]。這些機制一起限制細胞內(nèi)脂肪酸及其衍生物過量積累。所以，要大量合成脂肪類生物燃料，必須打破其調(diào)節(jié)機制，促進脂肪酸大量合成。最常用的策略之一是敲除脂肪酸分解途徑關(guān)鍵基因fadD和fadE以減少脂肪酸分解；另外，過表達植物來源以及內(nèi)源的硫酯酶解除長鏈脂酰-CoA反饋抑制，也可以加強脂肪酸合成[15]。

圖1 E. coli中脂肪酸代謝途徑[15]Fig. 1 The fatty acid metabolism in E. coli[15].

2.2 脂肪酸途徑改造合成生物柴油

生物柴油是指短鏈一元烷醇脂肪酸酯，目前生物柴油通常是通過甘油三酯與短鏈醇類進行酯交換反應(yīng)得到[16]。隨著生物柴油需求增加，這個策略暴露了越來越多的缺點。首先其依賴于植物油脂供應(yīng)，我國植物油脂資源極其短缺，現(xiàn)有油料作物年產(chǎn)油脂在1 000萬t左右，尚不足以滿足國內(nèi)食用油消費市場需求[17]。近幾年油脂進口量逐年遞增，2009年超過900萬t，是全球最大植物油凈進口國。其次生物柴油轉(zhuǎn)酯化需要消耗大量勞動力和能量，勢必會減少其轉(zhuǎn)化率，增加成本[2]。所以迫切需要尋找新技術(shù)以支撐生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為了解決這個問題，策略之一是尋找新的油脂來源。微生物油脂因其生產(chǎn)強度高，占用耕地面積少而受到廣泛關(guān)注[18]；另一種策略是利用微生物直接生產(chǎn)生物柴油，這種策略避免了轉(zhuǎn)酯化等過程，也引起了重視。在 E. coli進行中過表達來源于運動單胞菌Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧酶增加乙醇供應(yīng)，并表達來源于貝氏不動桿菌 Acinetobacter baylyi的?；D(zhuǎn)移酶。在培養(yǎng)基中添加油酸進行有氧發(fā)酵，脂肪酸乙酯(FAEE) 產(chǎn)量達到1.28 g/L，F(xiàn)AEE含量達到細胞生物量的 26%[2]。由于這個過程要在胞外添加油酸，使其更像一個生物轉(zhuǎn)化過程，但 FAEE高產(chǎn)量對未來脂肪酸途徑改造研究具有重要參考價值。

為了實現(xiàn)生物柴油體內(nèi)生物合成，敲除 E. coli DH1脂肪酸分解基因fadD增加脂肪酸供應(yīng)，表達硫酯酶TesA、脂酰-CoA連接酶ACL、酯合成酶AtfA，從而構(gòu)建了脂肪酸乙酯 (FAEE) 生物合成途徑。然后過表達來源于 Z. mobilis的丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶加強乙醇生物合成途徑，F(xiàn)AEE產(chǎn)量最大達到674 mg/L，為理論產(chǎn)量的7.4%[19]。相信對生物合成途徑進行優(yōu)化改造能進一步提高FAEE產(chǎn)量。

2.3 脂肪酸途徑改造合成脂肪酸和脂肪醇

脂肪酸是微生物合成生物柴油的前體，也可以用作油脂化工行業(yè)的基本原料。如果能利用微生物過量生產(chǎn)脂肪酸，對生物燃料和生物基化學品生產(chǎn)具有重要價值。因此，已有研究對脂肪酸生物合成途徑進行改造并增加脂肪酸產(chǎn)量。如通過敲除E. coli的fadD基因限制長鏈脂肪酸分解途徑；過表達來源于油料植物種子的硫酯酶以加強脂肪酸合成速率；過表達乙酰-CoA羧化酶增加前體丙二酸單酰-CoA的供應(yīng)；表達內(nèi)源硫酯酶解除長鏈脂酰-CoA反饋抑制，最后脂肪酸產(chǎn)量達到2.5 g/(L·d)，生產(chǎn)強度為0.024 g/(h·g DCW)[20]。在此基礎(chǔ)上，將油料植物種子的硫酯酶和E. coli內(nèi)源的硫酯酶在阿拉伯糖誘導啟動子下串聯(lián)表達，脂肪酸產(chǎn)量達到4.0 g/(L·d)，生產(chǎn)強度達到0.04 g/(h·g DCW)。這已經(jīng)很接近現(xiàn)在乙醇工業(yè)的生產(chǎn)強度0.1 g/(h·g DCW)[21]。有類似報道在敲除脂肪酸分解途徑的菌株中過表達來源于植物的脂酰-ACP硫酯酶和乙酰-CoA羧化酶獲得了約0.8 g/L脂肪酸[22]。在高產(chǎn)脂肪酸菌株的基礎(chǔ)上，通過表達脂酰-CoA連接酶和脂酰-CoA還原酶，構(gòu)建了脂肪醇生物合成途徑，脂肪醇產(chǎn)量達到60 mg/L[19]。除E. coli外，也有報道對藍細菌脂肪酸合成進行改造[23]，在藍細菌Synechocystis sp. PCC6803中過表達來源于好好芭 Simmondsia chinensis的脂酰-ACP還原酶，利用CO2作為碳源，脂肪醇產(chǎn)量達到0.2 mg/(L·OD730)。但是藍細菌脂肪酸途經(jīng)調(diào)節(jié)機理不夠清楚，如何進一步進行代謝工程改造制約著產(chǎn)量進一步提高。

2.4 脂肪酸途徑改造合成脂肪烴

烷烴和烯烴是汽油、柴油、航空煤油的最主要成分。在自然界中，許多生物能夠體內(nèi)能夠合成烴類化合物，藍細菌就是其中一種。然而，其生物合成的一些關(guān)鍵代謝步驟還沒有得到清晰認識，因此也就很難通過合成生物學構(gòu)建烴類生物合成途徑。美國LS9公司通過差減策略從藍細菌Synechococcus elongatus PCC7942中鑒定到烷烴生物合成基因脂酰-ACP還原酶編碼基因和醛脫羰基酶基因，并對其表達酶生物化學性質(zhì)進行了研究，其催化生物反應(yīng)如圖2所示。在E. coli中共表達脂酰-ACP還原酶和醛脫羰基酶，得到超過300 mg/L的烷烴，并且80%以上的烷烴是在細胞外。除了烷烴外，還生成了一定的醇類，這可能是由大腸桿菌內(nèi)源的還原酶將中間產(chǎn)物脂肪醛還原產(chǎn)生的[24]。但是，在體外實驗中脂酰-ACP還原酶和醛脫羰基酶共同催化脂酰-ACP并沒有醇生成。如果增加醛脫羰基酶活力，并且通過代謝工程改造降低細胞內(nèi)源的脂肪醛還原酶活力有可能將細胞內(nèi)積累的醇類進一步轉(zhuǎn)化為中長鏈烴，提高脂肪烴生產(chǎn)能力。

圖2 脂肪烴生物合成途徑Fig. 2 Alkane/Alkene biosynthesis pathway.

3 脂肪族生物燃料生物制造的展望

利用合成生物學理論與技術(shù)已實現(xiàn)了生物柴油、生物汽油、中長鏈烷烴等的微生物合成，但其產(chǎn)量還不夠高，尚不能達到工業(yè)化生產(chǎn)水平。進一步通過合成生物學及代謝工程手段構(gòu)建高產(chǎn)菌株是未來發(fā)展方向。將來可以從3個方面入手 (圖3)：1) 挖掘與改造合成生物學元件。自然界中資源豐富，有很多高效基因及酶有待于挖掘，設(shè)計高通量的篩選策略挖掘高效的基因元件為下一步合成生物學改造提供材料。近幾年興起的宏基因組技術(shù)和比較基因組學是篩選生物元件良好策略，如利用宏基因組技術(shù)從白蟻中發(fā)現(xiàn)了多個纖維素酶[25]，最近又有報道利用宏基因組技術(shù)從牛胃中發(fā)現(xiàn)一系列纖維素酶[26]，為纖維素高效利用菌株構(gòu)建提供了材料。另外，自然界中挖掘的元件異源表達時有時候活性不高，選擇性不夠，需要進一步通過蛋白質(zhì)工程和酶工程改造或者根據(jù)其功能設(shè)計新型元件使其更高效[27-28]。2) 組裝生物燃料相關(guān)元件并協(xié)調(diào)其功能。DNA組裝技術(shù)為代謝途徑快速組裝提供了很好的方案[29]。通過在E. coli中表達含有多種結(jié)構(gòu)域的蛋白支架 (Protein scaffold)，加州大學學者成功地將代謝途徑相關(guān)的酶錨定在蛋白支架上，代謝流得到協(xié)調(diào)，目標產(chǎn)物生產(chǎn)能力提高77倍[30]。但是，蛋白質(zhì)支架技術(shù)在其他宿主特別是真核生物以及其在不同途徑中的有效性，目前尚不清楚，所以必須發(fā)展新技術(shù)調(diào)控代謝流。3) 提高宿主對燃料分子的耐受性。生物燃料分子的毒性直接影響細胞生長及代謝，從而限制產(chǎn)量進一步提高，所以增加宿主產(chǎn)物耐受性對獲得高產(chǎn)很有必要。傳統(tǒng)馴化篩選策略雖然能獲得耐受性好的菌株，但比較耗時耗力，且菌株遺傳性狀不夠穩(wěn)定，易于產(chǎn)生回復突變。近幾年發(fā)展的全局轉(zhuǎn)錄工程通過改造轉(zhuǎn)錄因子，獲得了穩(wěn)定的乙醇高耐受性菌株，值得借鑒[31]。另外，有學者通過人工轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)，使E. coli對丁醇的耐受性提高到1.5%[32]。如果能夠在這三方面整體突破，將會獲得高產(chǎn)量脂肪類生物燃料生產(chǎn)菌株。

圖3 脂肪族生物燃料合成生物學改造方向Fig. 3 The future aspects for enhancing fatty biofuel production.

目前，合成生物學宿主一般采用遺傳操作平臺成熟的模式生物。然而，它們的脂肪酸代謝能力還遠低于產(chǎn)油微生物。另外，模式生物工程菌株可能存在如產(chǎn)物耐受性低、原料適應(yīng)范圍窄、抗逆性弱等性狀缺陷。而產(chǎn)油微生物脂肪酸生物合成能力強，并且還存在高效異戊二烯途徑，如果實現(xiàn)類胡蘿卜素、甾醇等聯(lián)產(chǎn)就有可能顯著降低生物燃料成本[33]。因此，選擇合適的宿主，構(gòu)建其遺傳操作平臺，充分利用微生物代謝產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)策略，可能是進一步提高微生物生物燃料生產(chǎn)競爭力的重要途徑[34]。

總之，脂肪族生物燃料由于其熱值高、不易揮發(fā)等良好性能受到廣泛關(guān)注。但目前還面臨菌株生產(chǎn)能力低、耐受性和原料適應(yīng)性差等問題[34]。合成生物學理念和技術(shù)將促進脂肪族生物燃料生物制造快速發(fā)展，為生物能源產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)支撐。

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Advanced biofuel-oriented engineering of fatty acid pathway：a review

Yongjin J. Zhou1,3, and Zongbao K. Zhao1,2
1 Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China
2 Dalian National Laboratory for Clean Energy, Dalian 116023, China
3 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Biofuel is in high demand as an alternative energy source for petroleum and diesel. Fatty acid-based biofuel has higher energy density and better compatibility with existing infrastructures. Microbial fatty acid biosynthetic pathway is important to develop biofuel. In this article, recent progresses on the modification and reconstruction of fatty acid metabolism for the production of biofuel were reviewed, with a focus on micro-diesel, long chain fatty alcohol and alkane. Problems, solutions and directions for further development of fatty acid-based biofuel were also discussed in the respect of synthetic biology.

synthetic biology, advanced biofuel, fatty acid metabolism, biodiesel

隨著經(jīng)濟快速發(fā)展，全球?qū)δ茉葱枨髣≡?。傳統(tǒng)化石能源日益枯竭難以支撐經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展，并且化石能源使用產(chǎn)生的溫室氣體對環(huán)境產(chǎn)生了巨大危害[1]，所以迫切需要發(fā)展替代石化能源的可再生能源。與石化燃料相比，生物燃料源于可再生的生物質(zhì)資源，其燃燒產(chǎn)生的CO2可經(jīng)植物光合作用重新轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)，實現(xiàn)綠色、可持續(xù)循環(huán)[2]。發(fā)展生物燃料對經(jīng)濟社會發(fā)展以及國家安全具有重要意義。得到了國內(nèi)外學術(shù)界和政府部門的重視，取得了很多令人振奮的成果。

April 7, 2011; Accepted: June 10, 2011

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB 707405).

Zongbao K. Zhao. Tel: +86-411-84379211; E-mail: zhaozb@dicp.ac.cn

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707405) 資助。