三種中藥復(fù)方制劑對雞MD的影響及其機制的研究

漢麗梅 王曉峰 孫娜 張金路 谷永生 孔延飛

在飼料中廣泛添加抗生素、激素等藥物防病治病及提高生產(chǎn)性能[1]，在為現(xiàn)代畜牧養(yǎng)殖帶來可觀的經(jīng)濟效益的同時，卻對產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生了影響，增加了畜產(chǎn)品中藥物殘留的風(fēng)險，可能會危害人類的健康。許多研究都發(fā)現(xiàn)中草藥具有無殘留、無抗藥性、無毒副作用、無污染并能顯著提高動物的生產(chǎn)性能、提高動物的抗病能力的特點[2-7]，使科技工作者越來越關(guān)注中草藥在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用研究。

雞馬立克氏病（Marek's Disease,MD）是由馬立克病毒(Marek's Disease virus,MDV)引起的一種淋巴組織增生性疾病[8],是很好的動物病毒型腫瘤的研究模型。應(yīng)用人類廣泛應(yīng)用的具有抗病毒作用的三種中藥復(fù)方:復(fù)方制劑1[9]、復(fù)方制劑2[10]、復(fù)方制劑3[11]，并對配方進行調(diào)整，進行了抗MDV感染的作用效果及其可能機理的研究與探討，為開發(fā)在畜牧生產(chǎn)中具有應(yīng)用前景的無藥物殘留的中藥抗病毒制劑，提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1日齡雞雛（無基礎(chǔ)免疫）由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗雞場提供。MDV京-1株血毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 MD模型的建立

1日齡雛雞腹腔接種MD病毒0.22 ml/只，建立MD動物模型。空白對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 中藥復(fù)方添加劑的加工與處理

中藥復(fù)方1主要以免疫促進作用、抗應(yīng)激作用、抗氧化作用的山茱萸、茯苓等成分為主；中藥復(fù)方2主要以白芍、川芎等保肝養(yǎng)血成分為主；中藥復(fù)方3主要以黃連、黃柏等抗炎抑菌的成分為主。三種中藥復(fù)方按照藥方進行配制，并研磨成粉，藥粉經(jīng)80目網(wǎng)篩篩選后，按0.5%添加量將復(fù)方制劑添加于飼料中。

1.2.3 試驗分組與給藥方式及樣品收集

180只1日齡雛雞隨機分空白對照組、攻毒對照組、攻毒試驗組(復(fù)方1組、復(fù)方2組、復(fù)方3組)。采用拌料給藥的方式，按設(shè)計的比例將復(fù)方制劑添加于飼料中。攻毒后，試驗組立即給藥，給藥期為14 d。給藥期結(jié)束后，在停藥后0、14、28 d進行采樣。

1.2.4 血清生化指標(biāo)的檢測與分析

血清總超氧化物歧化酶（SOD）的測定采用黃嘌呤氧化酶法測定，結(jié)果計算以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個亞硝酸鹽單位（NU）[12]；血清丙二醛（MDA）的測定采用過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可以與硫代巴比妥（TBA）縮合，形成紅色產(chǎn)物，此產(chǎn)物在532 nm處有最大吸收峰。端粒酶活性測定采用改進的Trap法進行端粒酶活性的測定[13]。應(yīng)用模版序列(R5:TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)為陽性對照，PCR引物序列（P1：5’-TCACC TTGTA ATCCG ATCCG TCGAGCAGAGTT-3’；P2：5’-CAACA TCTCC ACTAC CTTCT AACCG TAACC-3’），銀染法鑒定，Bandscan軟件處理圖像，進行活性分析。采用MTT法測定T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率；免疫器官指數(shù)比的計算：脾臟、胸腺、法氏囊重量之和與雞活體重的比。玫瑰花環(huán)試驗方法采用淋巴細胞懸液0.02 ml，加入1%紅細胞懸液0.02 ml輕震混合，37℃溫箱或水浴保溫5 min，低速離心（500 r/min）5 min，在4℃放置1～2 h，推片，自然干燥，美蘭染色后分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 給藥結(jié)束后第0 d各指標(biāo)的動態(tài)變化

給藥結(jié)束后第0 d，復(fù)方制劑1組SOD活性顯著高于對照組和其它各組（P＜0.05），MDA含量顯著低于對照組和其它各組（P＜0.05），玫瑰花換率顯著高于空白及攻毒對照組（P＜0.05）；復(fù)方制劑1、2組端粒酶活性均顯著低于攻毒對照組（P＜0.05），復(fù)方制劑3組端粒酶活性顯著高于其它各組；三種不同復(fù)方制劑組的免疫器官指數(shù)比均顯著低于攻毒對照組、空白對照組（P＜0.05）；玫瑰花環(huán)率變化不明顯，淋巴細胞轉(zhuǎn)化率值均高于空白對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜合分析表明，給藥結(jié)束后第0 d，復(fù)方制劑1飼料添加飼喂MDV感染雞，能增強機體的抗氧化能力和提高機體的免疫機能，在一定程度上降低MDV對機體的損傷程度（見圖1、圖2）。

圖1 給藥結(jié)束后第0 d組間各指標(biāo)比較結(jié)果

圖2 給藥結(jié)束后第14 d組間各指標(biāo)比較結(jié)果

2.2 給藥結(jié)束后第14 d各指標(biāo)的動態(tài)變化

給藥結(jié)束后第14 d，各復(fù)方制劑組SOD活性顯著低于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復(fù)方制劑1組的SOD活性顯著高于其它兩種復(fù)方制劑組（P＜0.05）；MDA含量顯著低于其它兩種復(fù)方制劑組；復(fù)方制劑2、3組MDA含量顯著高于攻毒對照組（P＜0.05），復(fù)方制劑1、2組端粒酶活性顯著低于攻毒對照組（P＜0.05）；三種不同復(fù)方制劑組的免疫器官指數(shù)比均低于攻毒對照組、空白對照組；三種不同復(fù)方制劑組T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率值均高于空白對照組；復(fù)方制劑1、2組T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率值低于攻毒對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜合分析表明，給藥結(jié)束后第14 d，復(fù)方制劑1飼料添加飼喂MDV感染雞，在停藥14 d后，腫瘤標(biāo)志物端粒酶的活性顯著降低，但是SOD活性與空白對照組相比，也同時降低，MDA含量也有所降低，免疫功能無明顯改善，說明藥效維持可能具有一定的時效性（見圖1、圖2）。

2.3 給藥結(jié)束后第28 d各指標(biāo)的動態(tài)變化

給藥結(jié)束后第28 d，三種不同復(fù)方制劑組SOD活性顯著低于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復(fù)方制劑1組的SOD活性顯著高于其它兩種復(fù)方制劑組（P＜0.05）；三種不同復(fù)方制劑組MDA含量顯著高于攻毒對照組和空白對照組（P＜0.05），復(fù)方制劑1、2組端粒酶活性顯著低于攻毒對照組（P＜0.05），高于空白對照組，復(fù)方制劑3組端粒酶活性顯著高于攻毒對照組（P＜0.05）。三種不同復(fù)方制劑組的免疫器官指數(shù)比均顯著低于攻毒對照組、空白對照組（P＜0.05）；復(fù)方制劑1組T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率值高于攻毒對照組、空白對照組及復(fù)方制劑2、3組，但無統(tǒng)計學(xué)意義（見圖1、圖2）。

綜合分析表明，復(fù)方制劑1在給藥期間，在一定程度上能提高機體的抗氧化能力、提高機體免疫力和降低腫瘤標(biāo)志物端粒酶的活性，在抗腫瘤生成和抗病毒感染方面起一定的作用，但藥效的維持有一定的時效性。

3 討論

利用我國的醫(yī)藥國寶“中草藥”進行抗腫瘤和抗病毒的研究已經(jīng)進入了一個成熟階段[14-17]，對其機理的研究也成為了熱點。王三龍[18]等認為中草藥在抗癌、防癌的方面有著巨大的潛能和美好的前景。厲將斌[19]等對復(fù)方921粗提物的研究中，發(fā)現(xiàn)其對腫瘤細胞的DNA合成有抑制作用，能誘導(dǎo)s期相關(guān)蛋白CycIinA表達下調(diào)。

機體的免疫系統(tǒng)具有限制腫瘤細胞生長的能力[20]。免疫系統(tǒng)能識別和殺死惡性腫瘤細胞，若免疫防護能力差或?qū)Σ徽＜毎R別能力差，會導(dǎo)致癌癥發(fā)生率的升高，因此免疫刺激劑和免疫調(diào)節(jié)劑被認為是潛在的抗癌劑[20]。因此具有抗癌、提高機體免疫力功能的中藥及其復(fù)方制劑成為新的研究熱點。

永生性的獲得是惡性腫瘤細胞的一個顯著生物學(xué)特性，也是腫瘤組織具有無限增殖能力的基礎(chǔ)，而腫瘤細胞無限增殖能力的維持則依賴于端粒酶的激活[21]。本研究在MDV感染雞不同時期，對血液和組織樣本進行了血液生化指標(biāo)、病理學(xué)變化、免疫指標(biāo)、機體抗氧化能力、端粒酶活性等的檢測分析。通過分析發(fā)現(xiàn)三種復(fù)方都能在一定程度上增強機體抗氧化能力以及清除體內(nèi)自由基的能力，降低細胞的損傷，提高免疫系統(tǒng)機能，同時抑制端粒酶活性，達到抑制細胞的永生化和抗腫瘤和抗病毒效果，但飼喂時間和效果之間的關(guān)系的研究，還有待深入。

利用中草藥添加劑抗病毒，其藥物處理簡單，成本低，無藥物殘留，降低對人體的間接危害，在畜牧生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景，但根據(jù)驗方開發(fā)中藥添加劑，對其有效的針對性應(yīng)用以及使用方式還有待深入探討。

[1] 周家炳,伍昭燕,等.中草藥與抗生素作為添加劑對本地雞生產(chǎn)性能的影響[J].畜禽業(yè)，2003(1)：6-7.

[2] 方俊,盧向陽,邱業(yè)先,等.中草藥飼料添加劑的研究進展、制約因素及對策[J].中國畜牧獸醫(yī)，2004,31(9):6-8.

[3] 王穎，周明.中草藥飼料添加劑的研究和應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(4)：701-702.

[4] 楊猛,王仁雷,黃亞東.中草藥飼料添加劑對小白鼠的毒理作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,2:227-228.

[5] 袁新虎.中草藥飼料添加劑在畜牧業(yè)中的應(yīng)用研究.[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37(21)：9997-9998.

[6] 樸香淑，李德發(fā).中草藥添加劑促進畜禽生產(chǎn)性能研究現(xiàn)狀及展望[J].飼料工業(yè)，2002，23(1)：12-15.

[7] 任艷.中草藥飼料添加劑在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(22)：10505—10506，10510.

[8] Mokbel K M,Parris C N,Ghilchi K M,et al.Telomerase activity and lymphovascular invasion in breast cancer[J].Eur J Surg Oncol,2000,26(1):30-33.

[9] 齊春會，張永祥，沈倍奮.六味地黃方現(xiàn)代藥理學(xué)研究新進展[A].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2003(26):463-510.

[10] 黃永明，劉金文，等.加味四物湯對荷骨肉瘤小鼠抑瘤作用[J].廣東醫(yī)學(xué)，2008(29)2074-2610.

[11] 孫健，溫慶輝，等.黃連解毒湯及其含藥血清的化學(xué)成分及抗腫瘤作用對比研究[A].2006(31):184-243.

[12] 遲玉杰,李慶章,于洪祥.ASP和LEN對vMDV感染雛雞SOD活性的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1997,28(2):157-163.

[13] 吳東林.端粒重復(fù)擴增程序(TRAP)的改進和應(yīng)用以及端粒酶酶學(xué)性質(zhì)研究[D].長春:解放軍軍需大學(xué),2001.

[14] William CS CHO.Scientific Evidence on the Supportive Cancer Care with Chinese Medicine[J].Chin J Lung Cancer,March 2010,13(3):190-194.

[15] 孫迎.中藥抗鴨病毒性肝炎研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2009，30(12)：71-74.

[16] 褚秀玲，蘇建青，韋旭斌.中草藥抗病毒的研究動態(tài)及思路[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48(5):1253-1256.

[17] Ju Dong,Shi-Yue Su,Min-Yan Wang,et al.Shenqi fuzheng,an injection concocted from chinese medicinal herbs,combined with platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer:a systematic review[J].Dong et al.Journal of Experimental&Clinical Cancer Research 2010,29:137-138.

[18] 王三龍,蔡兵,崔承彬,等.中草藥及其活性成分抗腫瘤的研究進展[J].ChineseTraditional andHerbal Drugs,2003,34(9):12-15.

[19] 厲將斌，李洪燕.中藥復(fù)方921粗提物抗腫瘤作用機理研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(11):.

[20] 祝國強，林冬梅，侯風(fēng)琴，等.黃連解毒湯對IBDV感染雞胚及雛雞免疫功能的影響[J].Animal Husbandry&Veterinary Medicine 2009,41(11):78-81.

[21] 丁強.中草藥及有效成分抑制腫瘤作用的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(9):1787-1790.