抗雙鏈DNA抗體不同檢測方法的比對分析

張春雷,周小梅,張書楠,呂 琪,陳桂冰,李慶寬

(1.深圳市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,廣東深圳 518020;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院2005級醫(yī)學(xué)檢驗系,湖南長沙 410078）

抗雙鏈DNA(double stranded DNA,dsDNA)抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(system ic lupus ery thematosus,SLE)患者的特征性標(biāo)志抗體[1-2],對于SLE的診斷和治療有著非常重要的作用,美國風(fēng)濕病學(xué)會已將其列為SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)之一,其特異性達(dá)到了(95～100)%?？筪sDNA抗體滴度的高低與SLE的活動密切相關(guān)[3-4],抗體滴度高提示SLE處于活動期。該抗體直接與腎小球細(xì)胞中DNA結(jié)合或與循環(huán)血液中DNA結(jié)合形成免疫復(fù)合物,沉積于腎小球基底膜,抗dsDNA抗體檢測是目前SLE患者診斷及治療最常用的指標(biāo)之一。檢測抗dsDNA抗體的方法較多,常用的有間接免疫熒光法(indirect immunofluorescent assay,IIFA)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印跡法(immunobiotting test,IBT)等,本課題將以上3種檢測方法進(jìn)行比較,具體報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年4月至2010年4月在深圳市中醫(yī)院就診,確診為SLE的患者血清標(biāo)本70人份(清晨空腹抽血,分離血清并置2～8℃冰箱備檢)作為實驗組,患者的選擇符合美國風(fēng)濕協(xié)會關(guān)于SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn),其中男12例,女58例,年齡 16～70歲,平均 34.5歲。將血常規(guī)、肝腎功能檢查結(jié)果正常的健康體檢者的血清標(biāo)本650人份作為健康對照組,其中,男305例,女 345例,年齡 20～ 50歲。

1.2 主要試劑與儀器 綠蠅短膜蟲dsDNA IIFA試劑盒(30T)、抗dsDNA抗體(IgG)ELISA檢測試劑盒(96T)、抗核抗體譜IBT試劑盒(64T)均購自德國歐蒙醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司;主要采用ZEISS型熒光顯微鏡(德國)、TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(上海)及 ELX-800型酶標(biāo)儀(美國)進(jìn)行實驗。

1.3 方法 同時采用IIFA、ELISA和IBT法對實驗組及健康對照組血清標(biāo)本進(jìn)行抗dsDNA抗體的檢測。3種方法嚴(yán)格按照試劑盒使用說書進(jìn)行操作,將試劑盒所帶的陽性對照、陰性對照與待測標(biāo)本同時測量。IIFA定性檢測:熒光顯微鏡下觀察到試劑盒檢測薄片綠蠅短膜蟲動基體出現(xiàn)蘋果綠熒光為陽性。ELISA半定量檢測:以標(biāo)準(zhǔn)品2(濃度100 IU/m L)為測定臨界值,與待測樣本同時測量,選擇酶標(biāo)儀比色波長為450 nm,參考波長為630 nm,加終止液后30m in之內(nèi)比色,其中測定結(jié)果大于或等于100 IU/m L為陽性,小于100 IU/m L為陰性。IBT定性檢測:反應(yīng)膜在特定位置出現(xiàn)肉眼可見的、與質(zhì)控帶顏色相同的顯色條帶為陽性,否則為陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 多樣本率的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

健康對照組與實驗組檢測結(jié)果見表1。實驗組IIFA法檢出的24例抗dsDNA抗體陽性標(biāo)本中,ELISA、IBT法檢測均為陽性;IBT法檢測的31例抗dsDNA抗體陽性標(biāo)本中,ELISA法檢測也為陽性。ELISA和IBT檢出陽性率與IIFA方法比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 IIFA、ELISA及IBT法檢測實驗組與健康對照組中抗dsDNA抗體的結(jié)果比較[n(%)]

3 討 論

實驗結(jié)果提示ELISA檢測抗dsDNA抗體敏感性最高,可進(jìn)行半定量檢測,有助于對SLE的診斷及病情活動程度的監(jiān)控[5-6]。同時,ELISA檢測不需要特殊設(shè)備,適合基層醫(yī)院及標(biāo)本量較多的實驗室進(jìn)行篩查,具有較好的市場前景。本實驗健康對照組ELISA檢測中有29例抗dsDNA抗體陽性,而臨床追蹤調(diào)查并未發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的臨床表現(xiàn),這可能是因為ELISA檢測的影響因素較多,譬如標(biāo)本稀釋、抗原板的洗滌、酶標(biāo)儀的校準(zhǔn)等均可造成結(jié)果誤差;其次,由于ELISA檢測采用生物提取dsDNA作為實驗基質(zhì),在制備過程中,DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)位點(diǎn)可能存在人為暴露,會因單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)抗體的存在而產(chǎn)生非特異性反應(yīng)[7-8]。盡管如此,由于ELISA檢測的高度敏感性,結(jié)合患者的臨床表現(xiàn),它仍不失為一種較好的篩查方法。

IIFA檢測抗dsDNA抗體是采用綠蠅短膜蟲作為抗原基質(zhì)進(jìn)行檢測的,其動基體只由高純度的環(huán)狀dsDNA構(gòu)成,除此之外,不含有其他細(xì)胞核抗原,因此具有高度特異性,被認(rèn)為是檢測細(xì)胞內(nèi)抗原自身抗體的金標(biāo)準(zhǔn)[9-10],是一種較好的確證方法。實驗中,IIFA、ELISA及IBT 3種方法均顯示抗dsDNA抗體陽性的標(biāo)本有24例,與患者臨床跟蹤調(diào)查結(jié)果一致。然而IIFA結(jié)果的判斷有一定的主觀性,易受檢測人員技術(shù)水平及主觀因素影響,且熒光顯微鏡價格昂貴,基層醫(yī)院難以開展,本實驗提示IIFA的敏感性相對較低,不能準(zhǔn)確定量。因此,IIFA檢測在臨床診斷和治療方面,難以起到準(zhǔn)確的監(jiān)測作用[11]。

IBT檢測抗dsDNA抗體操作簡便、省時、特異性好、用血量少、無需特殊設(shè)備、重復(fù)性好,可同時完成對14種自身抗體的識別和過篩,對提高自身免疫疾病的診斷水平有很大的幫助,適合于各大醫(yī)院推廣應(yīng)用。然而IBT檢測中,由于一張硝酸纖維膜上有數(shù)種成分顯示,多個條帶相距很近,每次電泳時不同蛋白質(zhì)在凝膠中遷移的速率不同以及蛋白質(zhì)區(qū)帶在電泳時形成的斜率,給這些條帶的識別帶來一定困難,特別是對臨界陽性的標(biāo)本,不同操作者對結(jié)果的判斷也不盡相同,很容易造成誤判或假陽性,IBT試劑在生產(chǎn)過程中可能發(fā)生抗原轉(zhuǎn)印不充分或轉(zhuǎn)印時發(fā)生抗原丟失,影響結(jié)果判定,導(dǎo)致假陰性[12]。

在臨床工作中,根據(jù)實際情況采用聯(lián)合檢測[13],并結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)來判斷結(jié)果。同時,提高ELISA檢測的特異性以及IIFA檢測的敏感性是當(dāng)前研究的重點(diǎn),目前利用熒光PCR檢測dsDNA含量的方法受到了越來越多的重視[14-15],在今后的檢驗工作中將扮演越來越重要的角色。

[1] Aganovic-M usinovic I,Prljaca-Zecevic L,Subasic D.The incidence of ANA and ETI-dsDNA detected by enzyme immunoassays and indirect immunofluorescence assay(IFA)[J].M ed A rh,2010,64(2):68-70.

[2] A lmogren A.Anti-doub le stranded antibody.Association with titers and fluorescence patterns of anti-nuclear antibody in system ic lupus erythematosus[J].Saudi Med J,2010,31(1):32-36.

[3] 牟君成,陳聯(lián),王文昕,等.ANA、抗 ENA抗體聯(lián)合檢測對自身免疫病診斷的意義[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(18):2334-2337.

[4] 姜友珍,莫碧媛.SLE患者ANA、抗ds-DNA及ENA聯(lián)合檢測的對照分析[J].廣西醫(yī)學(xué),2006,28(4):524-525.

[5] Villalta D,Bizzaro N,Corazza D,etal.Eva luation of anew automated enzyme fluoroimmunoassay using recombinant p lasm id dsDNA for the detection o f anti-dsDNA antibodies in SLE[J].Clin Lab Anal,2002,16(5):227-232.

[6] Radice A,Sinico RA.A new oligonucleotide-based ELISA for the detection of anti-double-stranded DNA antibodies[J].Autoimmunity,2006,39(2):113-119.

[7] Makow skiGS,Ramsby ML.Selective detection o f autoimmune antibodies to sing le-and double-stranded DNA by enzyme immunoassay[J].Ann Clin Lab Sci,2003,33(2):142-148.

[8] 王毅,肖華勇,傅仕俊.ELISA定量檢測dsDNA、ssDNA、H istone抗體的初步評估[J].重慶醫(yī)學(xué),2003,32(3):353-354.

[9] 武永康,王蘭蘭,唐江濤,等.抗核抗體不同檢測方法的對比分析[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2006,10(10):610-614.

[10]Conrad K,Ittenson A,Reinhold D,et al.H igh sensitive detection of double-stranded DNA autoantibodies by a modified Crithidia luciliae immunofluorescence test[J].Ann N Y A cad Sci,2009,1173:180-185.

[11]A lmogren A.Anti-doub le stranded antibody.Association with titers and fluorescence patterns of anti-nuclear antibody in system ic lupus erythematosus[J].Saudi Med J,2010,31(1):32-36.

[12]馬東來,張少靜,StockerW.自身抗體及其免疫熒光模式[M].北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社,2000:2-3.

[13]汪國生,錢龍,張宏,等.聯(lián)合檢測C1q抗體、雙鏈 DNA抗體對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價值[J].中國綜合臨床,2006,22(5):411-414.

[14]劉歆,徐根明,郭江鋒,等.基于 SYBR Green I的雙鏈DNA定量方法[J].中國生物工程雜志,2008,28(1):55-60.

[15]謝飛,馬雪梅.SYBR G reen I熒光檢測法測定雙鏈DNA含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,26(11):1357-1359.