載脂蛋白J及補體C3在大鼠腦出血模型中表達的實驗研究

鄭曉梅,劉 亮,李小剛

(1.四川省瀘州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 646000;2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 646000;3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000）

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經(jīng)系統(tǒng)多發(fā)病,嚴重威脅人類健康。補體激活所致的炎癥反應(yīng)和細胞凋亡在ICH繼發(fā)性損傷中的作用日益受到重視[1]。載脂蛋白 J(apolipoprotein J,ApoJ)是一種多功能糖蛋白,參與補體調(diào)控、細胞凋亡及DNA修復(fù)等多種生理功能[1]。目前,國內(nèi)外對ApoJ在ICH過程中所起作用的報道不多。有學(xué)者認為在阿爾茨海默病及腦梗死等疾病中,A poJ有神經(jīng)元保護作用,ApoJ可清除阿爾茨海默病患者腦組織中沉積的β-淀粉樣蛋白而延緩老年性癡呆[2]。既往研究表明,補體系統(tǒng)參與了ICH后的神經(jīng)元死亡。ApoJ作為公認的補體調(diào)節(jié)因子,是否通過抑制ICH后的補體激活來阻止補體介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡,是本研究的切入點。本文通過探討ApoJ在ICH過程中的作用機制,為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。WDT-V型鼠腦立體定向儀購自西安西北光電儀器廠。

1.2 動物分組與建模 Sprauge-Daw ley(SD)大鼠150只(鼠齡 3～4個月、體質(zhì)量 250～350 g)購自瀘州醫(yī)學(xué)院動物中心,合格證號:川醫(yī)動字2401115。將SD大鼠隨機分為3組:正常對照組(n=10)、假手術(shù)組(n=70)及 ICH組(n=70);假手術(shù)組與ICH組(出血量為50μL)分別按假手術(shù)術(shù)后時間及出血后時間分為 3、6、12 h以及1、3、5、7 d等7個亞組(n=10)。采用參考文獻[3]的實驗方法,通過腦立體定向儀將自體血注入尾狀核,制作大鼠ICH模型。根據(jù)Bederson等[4]的評定方法將神經(jīng)功能缺損程度分為4級,將手術(shù)后2 h大鼠神經(jīng)功能缺損程度達1、2、3級判斷為建模成功。假手術(shù)組穿刺留針后取出,穿刺留針過程與手術(shù)組相同。

1.3 腦組織含水量測定 采用干濕質(zhì)量法,各組在規(guī)定時間點處死大鼠,收集血腫周圍的腦組織,質(zhì)量約200mg,100℃烘烤24 h,烘烤前、后用天平稱量。含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

表1 ApoJ、補體C3及β-actin m RNA的引物序列

1.4 RT-PCR檢測 分別取各組腦組織勻漿,按一步法總RNA提取試劑盒說明書提取總 RNA,合成 cDNA,然后用PTC 220型PCR熱循環(huán)儀擴增cDNA,引物序列見表1。β-actinmRNA作為內(nèi)參。將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用Eagle EyeⅡ型圖像分析處理系統(tǒng)對電泳帶進行掃描,根據(jù)各條帶光密度值,計算ApoJ、補體C3 mRNA表達的相對水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析和相關(guān)性分析,計量數(shù)據(jù)用±s表示,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)多個樣本均數(shù)的兩兩比較法,組內(nèi)各時間點比較采用t檢驗,相關(guān)分析應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)法,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量的動態(tài)變化 在3 h至7 d各時間點,ICH組的腦組織含水量明顯高于相應(yīng)時間點的正常對照組及假手術(shù)組(P＜0.05),其中以 ICH 3 d組的腦組織含水量最高,見表2。

表2 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較(±s,%)

表2 各組大鼠不同時間點腦組織含水量比較(±s,%)

*:P＜0.05,與假手術(shù)組及正常對照組比較;△:P＜0.05,與ICH 3 d組比較;-:表示此項無數(shù)據(jù)。

假手術(shù)后或出血后時間組別3 h 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d 7 d ICH 組 77.96±1.52*△ 78.83±0.56*△ 79.28±0.35*△ 80.43±0.44*△ 81.95±0.31*79.18±0.35*△78.02±0.20*△假手術(shù)組 73.90±0.46 74.06±0.71 74.78±0.92 74.86±0.51 74.30±0.49 73.90±0.51 73.80±0.39正常對照組 73.47±0.33 - - - - - -

表3 各組大鼠不同時間點腦組織補體C3 mRNA的表達水平比較(±s)

表3 各組大鼠不同時間點腦組織補體C3 mRNA的表達水平比較(±s)

*:P＜0.05,與假手術(shù)組及正常對照組比較;△:P＜0.05,與ICH 3 d組比較;-:表示此項無數(shù)據(jù)。

假手術(shù)后或出血后時間組別3 h 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d 7 d ICH 組 0.19±0.01△ 0.24±0.05*△ 0.36±0.08*△ 0.52±0.05*△ 0.71±0.05* 0.52±0.04*△ 0.34±0.05*△假手術(shù)組 0.18±0.01 0.18±0.01 0.19±0.01 0.19±0.01 0.19±0.01 0.18±0.01 0.18±0.01正常對照組 0.18±0.01 - - - - - -

表4 各組大鼠不同時間點腦組織ApoJ m RNA的表達水平比較(±s)

表4 各組大鼠不同時間點腦組織ApoJ m RNA的表達水平比較(±s)

*:P＜0.05,與假手術(shù)組及正常對照組比較;△:P＜0.05,與ICH 3 d組比較;-:表示此項無數(shù)據(jù)。

假手術(shù)后或出血后時間組別3 h 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d 7 d ICH 組 0.50±0.03*△ 0.54±0.04*△ 0.65±0.04*△ 0.72±0.04*△ 0.97±0.02* 0.82±0.03*△ 0.66±0.03*△假手術(shù)組 0.42±0.02 0.42±0.02 0.43±0.02 0.43±0.03 0.45±0.02 0.43±0.01 0.43±0.01正常對照組 0.41±0.02 - - - - - -

圖1 ICH組大鼠腦組織補體C3mRNA的電泳圖

圖2 ICH組大鼠腦組織ApoJ mRNA的電泳圖

2.2 補體C3 mRNA的表達 在各時間點,正常對照組及假手術(shù)組大鼠腦組織的補體C3 mRNA呈低水平表達;除外ICH 3 h組,ICH組各時間點補體C3 m RNA表達明顯高于相應(yīng)時間點的正常對照組及假手術(shù)組(P＜0.05);ICH 3 d組補體C3mRNA的表達水平最高,見表3、圖1。

2.3ApoJmRNA的表達 在各時間點,正常對照組及假手術(shù)組大鼠腦組織ApoJmRNA呈低水平表達;ICH組ApoJmRNA表達明顯高于正常對照組及假手術(shù)組(P＜0.05),ICH 3 d組Apo JmRNA的表達水平最高,見表4、圖2。

2.4 相關(guān)性分析 應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析ICH組各檢測指標間的相關(guān)性。補體C3、Apo Jm RNA的表達水平與血腫周圍腦組織含水量呈正相關(guān)(R=0.758,P＜0.05;R=0.702,P＜0.05),提示ICH后腦水腫與補體系統(tǒng)有關(guān),Apo J蛋白可能間接參與腦水腫的形成,見圖3、4;ApoJmRNA與補體C3 mRNA的表達水平呈正相關(guān)(R=0.908,P＜0.05),提示ICH后ApoJ參與了補體調(diào)控,見圖5。

圖3 補體C3mRNA表達水平與血腫周圍腦組織含水量的關(guān)系

圖4 Apo J mRNA表達水平與血腫周圍腦組織含水量的關(guān)系

圖5 ApoJ mRNA與補體C3m RNA表達水平的關(guān)系

3 討 論

ApoJ是雜二聚體糖蛋白,由α、β鏈組成,分布于血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)2及 HDL3中,與含Apo-A I和膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白活性的HDL亞型關(guān)系密切。ApoJ與Apo-A I一起形成 HDL復(fù)合物,參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、補體功能調(diào)節(jié)等多種生理功能[11]。正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞可低水平表達ApoJm RNA[12],而當(dāng)細胞受損時,其表達可能增加。Nuutinen等[13]認為位于細胞核的ApoJ可誘導(dǎo)細胞凋亡,而當(dāng)促凋亡蛋白Bax表達增加時,位于細胞線粒體的ApoJ表達增加,呈聚集狀態(tài),發(fā)揮保護細胞的作用。K im等[14]認為分泌型ApoJ通過抑制DNA合成而阻止受損血管平滑肌細胞的過度增殖,減少TNF-α誘導(dǎo)的凋亡,促進內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶的表達。李艷玲和何志義[15]認為,在大鼠腦梗死后,ApoJ的表達代償性增加以抑制補體活性,從而抑制補體介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡,發(fā)揮神經(jīng)元保護作用。然而,Hakkoum等[16]發(fā)現(xiàn)在腦缺血的體外模型中,A poJ可加重受損細胞死亡。

本實驗還發(fā)現(xiàn),ApoJmRNA表達上調(diào)在ICH后先于補體C3 mRNA的表達上調(diào),這可能源于機體因ICH損傷而產(chǎn)生的內(nèi)源性應(yīng)激反應(yīng),其機制還有待進一步闡明。

綜上所述,ApoJ作為 MAC抑制劑,在 ICH過程中,通過抑制補體系統(tǒng)的激活而減輕腦水腫、保護神經(jīng)元。根據(jù)Apo J在ICH后的變化規(guī)律以及ApoJ作為內(nèi)源性補體抑制劑,它能否成為臨床上監(jiān)測腦水腫程度的間接指標、在治療腦損傷過程中發(fā)揮重要作用還有待進一步研究。

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