• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成相關(guān)酶有助于1,4-丁二醇轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸

    2011-02-09 09:36:46張?chǎng)?/span>陳國(guó)強(qiáng)
    生物工程學(xué)報(bào) 2011年12期
    關(guān)鍵詞:丁二醇胞內(nèi)脫氫酶

    張?chǎng)?,陳?guó)強(qiáng)

    清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100084

    4-羥基丁酸 (4-hydroxybutyrate,4HB) 作為神經(jīng)遞質(zhì)是 γ-氨基丁酸的代謝物,以很低的含量存在于哺乳動(dòng)物大腦中,在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域里被認(rèn)為是一種神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)于自我平衡調(diào)整和產(chǎn)生有規(guī)律的睡眠等方面起著非常重要的作用[1]。4-羥基丁酸可經(jīng)氧化轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁岚肴㈢晁?,最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)而被代謝降解[2-3]。琥珀酸半醛脫氫酶缺陷的患者會(huì)在體液中積累很高濃度的 4-羥基丁酸,并表現(xiàn)出遲鈍、癲癇等癥狀[4]。4-羥基丁酸具有與鹽酸氯胺酮類似的麻醉效果,且能刺激體內(nèi)荷爾蒙素的分泌,因而被歸為管制藥品[5-6]。

    4-羥基丁酸的另一常見用途是作為生物塑料聚3-羥基丁酸酯 4-羥基丁酸酯 (P3HB4HB) 的合成前體,它在共聚物中的比例直接影響著最終P3HB4HB的材料學(xué)性質(zhì)和降解性[7-11]。盡管 4-羥基丁酸可在厭氧菌克氏梭菌Clostridium kluyveri對(duì)乙醇、乙酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生[12],也存在于古細(xì)菌勤奮金屬球菌Metallosphaera sedula等的 3-羥基丁酸/4-羥基丁酸固碳途徑中[13],卻不能在羅氏真養(yǎng)菌 Ralstonia eutropha、大腸桿菌Escherichia coli等常用的PHA合成菌中形成。因此需要添加結(jié)構(gòu)相關(guān)碳源,如 4-羥基丁酸、γ-丁內(nèi)酯或者1,4-丁二醇作為4-羥基丁酸的來源[14-17],這些添加物主要以石化產(chǎn)品為原料經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化制備[18-20]。

    張磊等利用來源于惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida KT2442的醇脫氫酶 (DhaT) 和醛脫氫酶(AldD) 催化完成 1,4-丁二醇向 4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化[21]。這里DhaT和AldD的催化作用需要輔酶因子NAD的參與 (圖1)。

    對(duì)輔酶因子的調(diào)節(jié)是代謝工程改造中的一個(gè)重要手段,提高胞內(nèi)NADH水平已成功用于促進(jìn)合成還原性產(chǎn)物如1,3-丙二醇[22]、琥珀酸[23]、丁醇[24]等。同理,提高胞內(nèi)NAD含量可能促進(jìn)1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化。煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (Nicotinic Acid Phosphoribosyltransferase,PncB) 和NAD合成酶 (NAD Synthetase,NadE) 是大腸桿菌NAD合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶,單獨(dú)表達(dá)時(shí)均使胞內(nèi)NAD (H)總量提高約 2.5倍,共表達(dá)時(shí)能夠提高近 7倍,且NAD增加量要多于 NADH增量[25]。因此,本研究通過在 E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中共表達(dá)pncB-nadE基因,提高1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化效率。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

    菌種Escherichia coli S17-1為清華大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒 pZL-dhaT-aldD由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[21]。本文所用菌種、質(zhì)粒及引物序列見表1。

    fastpfu DNA聚合酶以及用于基因克隆的E. coli DH5α為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶為Fermentas產(chǎn)品。質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒為博邁德公司產(chǎn)品。

    1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

    質(zhì)粒構(gòu)建過程以及搖瓶種子液均采用 LB培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為另外添加了10 g/L 1,4-丁二醇的 LB培養(yǎng)基。根據(jù)重組菌攜帶質(zhì)粒的抗性向滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中加入抗生素,其中氨芐青霉素濃度為100 mg/L,卡那霉素濃度為50 mg/L。

    培養(yǎng)條件為37 ℃,200 r/min。除搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48 h外,其余情況均培養(yǎng)12 h。

    圖1 1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig. 1 Conversion of 1,4-BD to 4HB.

    表1 本研究中所使用的菌種、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

    1.3 NAD (H) 含量測(cè)定

    按照已報(bào)道方法提取胞內(nèi)NAD和NADH[22],略有修改。將3 mL搖瓶發(fā)酵菌液于4 ℃離心收集細(xì)胞,棄上清。將細(xì)胞用冰冷的去離子水洗滌2次后充分重懸于0.2 mL去離子水中。加入50 μL 0.4 mol/L HCl (提取NAD) 或者0.4 mol/L KOH (提取NADH),充分混勻后在冰上放置10 min。NAD提取液在50 ℃水浴,NADH提取液在30 ℃水浴。10 min后迅速移到冰上加入50 μL 0.4 mol/L KOH (提取NAD) 或者0.4 mol/L HCl (提取NADH) 進(jìn)行中和。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。上清液即為NAD (H) 的提取液,將其移至新的離心管中,立即檢測(cè)。

    含量測(cè)定采用酶循環(huán)法,反應(yīng)體系為 (1 mL):450 μL HEPES 緩沖液 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,0.15 mol/L,pH 7.4);200 μL 5-乙基吩嗪硫酸鹽 (PES,4 mg/mL);200 μL噻唑藍(lán) (MTT,5 g/L);50 μL乙醇;50 μL的600 U/mL乙醇脫氫酶 (ADH)。上述反應(yīng)液混勻后37 ℃溫育5 min,加入50 μL的NAD (H) 的提取液起始反應(yīng)。測(cè)定5 min內(nèi)OD570的變化。吸光度-時(shí)間曲線的斜率反應(yīng)出提取液中NAD (H) 的濃度。

    1.4 分析方法

    1.4.1 細(xì)胞干重的測(cè)定

    培養(yǎng)結(jié)束后,12 000 r/min、10 min離心收集菌體,然后用去離子水洗滌、離心,去掉菌體表面粘附的培養(yǎng)基成分。將得到的細(xì)胞在抽真空條件下冰凍干燥至恒重,測(cè)定細(xì)胞干重 (Dry cell weight,DCW)。

    1.4.2 產(chǎn)物濃度的測(cè)定

    4-羥基丁酸的分析方法參考文獻(xiàn)[21],取菌液離心后上清進(jìn)行冰干、酯化和氣相色譜分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 pncB/nadE基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

    以E. coli MG1655基因組DNA為模板,表1中相應(yīng)引物用 fastpfu DNA聚合酶對(duì)基因 pncB和nadE進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性20 s,58 ℃復(fù)性20 s,72 ℃延伸45/30 s,30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸8 min。

    將pncB/nadE基因的PCR回收片段和表達(dá)載體pEn分別進(jìn)行 Sac Ⅰ/Xba Ⅰ酶切,連接后化學(xué)法轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)中,陽性克隆經(jīng)EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切,得到目的基因表達(dá)單元和載體骨架兩條帶 (圖2),證明質(zhì)粒pEnpncB和pEnnadE構(gòu)建成功。再用Avr Ⅱ/Xho Ⅰ酶切pEnnadE,回收nadE表達(dá)單元一段,將其插入經(jīng)Nhe Ⅰ/Xho Ⅰ酶切的pEnpncB中,因?yàn)锳vr Ⅱ和Nhe Ⅰ是同尾酶,因此兩片段可相連得到質(zhì)粒pEnpncBnadE。經(jīng)Xba Ⅰ酶切驗(yàn)證正確后與質(zhì)粒 pZL-dhaT-aldD一起經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入E. coli S17-1感受態(tài),獲得重組菌株。已有報(bào)道,基于 pBBR1MCS2所構(gòu)建的質(zhì)粒能夠與pMD19-T Simple的衍生質(zhì)粒共存[26],因此,這里的pZL-dhaT-aldD和 pEnpncBnadE能夠協(xié)同作用。進(jìn)一步質(zhì)粒提取證實(shí)了兩質(zhì)粒的相容性。

    2.2 重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果

    以E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 為參照,驗(yàn)證PncB-NadE表達(dá)對(duì)1,4-丁二醇轉(zhuǎn)化的影響 (表2)。

    野生型大腸桿菌也能由 1,4-丁二醇合成少量4-羥基丁酸,卻不能進(jìn)一步代謝利用 4-羥基丁酸[16,21,27]。另外,基因dhaT和 (或) aldD在嗜水氣假單胞菌 Aeromonas hydrophila 4AK4與 E. coli S17-1中顯示出相似的作用效果,而 A. hydrophila 4AK4 (pZL-dhaT-aldD) 的55 h發(fā)酵結(jié)果顯示4-羥基丁酸積累量不斷上升[21]??赏茢郋. coli S17-1重組菌的 4-羥基丁酸積累量以及 1,4-丁二醇的消耗量在發(fā)酵過程中應(yīng)是逐漸增大的,因此,這里以48 h發(fā)酵后的結(jié)果作為討論依據(jù)。

    對(duì)照組E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 由10 g/L的 1,4-丁二醇合成 4.31 g/L 4-羥基丁酸,轉(zhuǎn)化率(mol/mol%) 為36.44%。而同條件下,E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD,pEnpncBnadE) 則得到4.87 g/L 4-羥基丁酸,1,4-丁二醇的轉(zhuǎn)化率為 41.18%,比對(duì)照組提高13.03%。計(jì)算單位細(xì)胞量的4-羥基丁酸產(chǎn)率能夠更直接說明PncB-NadE的作用。對(duì)照組單位細(xì)胞產(chǎn)率為1.32 g/g,實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)值為1.86 g/g。綜上結(jié)果,PncB-NadE的共表達(dá)明顯促進(jìn)4-羥基丁酸的合成。

    盡管如此,仍有近60%的1,4-丁二醇未被利用,這是因?yàn)榇济摎涿?(DhaT) 對(duì)1,4-丁二醇活性不高,且發(fā)酵后期會(huì)進(jìn)一步減弱[21],所以,需要篩選出更有效的酶來催化反應(yīng)以充分利用1,4-丁二醇。

    此外,PncB-NadE的表達(dá)同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞干重下降??赡苁且?yàn)榘麅?nèi)NAD的增加導(dǎo)致氧化還原態(tài)失衡,影響了細(xì)胞的正常代謝。細(xì)胞總量減少是轉(zhuǎn)化率不能充分提高的另一原因,可通過添加葡萄糖等有利碳源來刺激細(xì)胞生長(zhǎng),進(jìn)而增加 1,4-丁二醇利用率。

    圖2 質(zhì)粒pEnpncB、pEnnadE、pEnpncBnadE的酶切圖譜Fig. 2 Characterization of pEnpncB, pEnnadE, pEnpncBnadE. M: 1 kb DNA marker; p: pEnpncB digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 532 bp and 2 706 bp; n: pEnnadE digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 173 bp and 2 706 bp; pn: pEnpncBnadE digested with Xba I, two brands were 1 155 bp and 4 238 bp.

    表2 重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)4-羥基丁酸Table 2 Production of 4-hydroxybutyric acid by E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE) and E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)

    2.3 NAD (H) 含量測(cè)定

    酶循環(huán)反應(yīng)中吸光度-時(shí)間曲線的斜率正比于提取液中 NAD (H) 的濃度。結(jié)果證明 PncB-NadE的表達(dá)確實(shí)能提高胞內(nèi)NAD (H) 濃度 (圖3)。結(jié)合表2計(jì)算單位質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)NAD和NADH含量變化,E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD,pEnpncBnadE) 比E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中NAD和NADH含量分別提高2.04倍和2.74倍。

    圖3 重組菌NAD (H) 含量測(cè)定Fig. 3 Relative concentration of NAD (H) in different recombinants. 1: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 2: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)); 3: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 4: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)).

    3 結(jié)論

    REFERENCES

    [1] Ye F, Dong FW. Review of analysis methods of γ-hydroxybutyrate and its derivatives. Merch Qual, 2011(S3): 156?157.葉峰, 董鳳偉. γ-羥基丁酸及其相關(guān)物分析研究綜述.商品與質(zhì)量, 2011(S3): 156?157.

    [2] Kaufman EE, Nelson T. An overview of γ-hydroxybutyrate catabolism: the role of the cytosolic NADP+-dependent oxidoreductase EC 1.1.1.19 and of a mitochondrial hydroxyacid-oxoacid transhydrogenase in the initial, rate-limiting step in this pathway. Neurochem Res, 1991, 16(9): 965?974.

    [3] Wong CGT, Chan KFY, Gibson KM, et al. Gamma-hydroxybutyric acid: neurobiology and toxicology of a recreational drug. Toxicol Rev, 2004, 23(1): 3?20.

    [4] Gibson KM, Hoffmann GF, Hodson AK, et al. 4-Hydroxybutyric acid and the clinical phenotype of succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency, an inborn error of GABA metabolism. Neuropediatrics, 1998, 29(1): 14?22.

    [5] Drasbek KR, Christensen J, Jensen K. Gamma-hydroxybutyrate-a drug of abuse. Acta Neurol Scand, 2006, 114(3):145?156.

    [6] Efe C, Straathof AIJ, van der Wielen LAM. Options for biochemical production of 4-hydroxybutyrate and its lactone as a substitute for petrochemical production. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(6): 1392?1406.

    本次計(jì)算中取泊松比為υ=0.35,Ib=0.7,rm=12.5。室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)得的主固結(jié)完成后的剪切模量為G=0.664 MPa。

    [7] Saito Y, Doi Y. Microbial synthesis and properties of poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in Comamonas acidovorans. Int J Biol Macromol, 1994, 16(2): 99?104.

    [8] Saito Y, Nakamura S, Hiramitsu M, et al. Microbial synthesis and properties of poly(3-hydroxybutyrateco-4-hydroxybutyrate). Polym Int, 1996, 39(3): 169?174.

    [9] Ishida K, Wang Y, Inoue Y. Comonomer unit composition and thermal properties of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)s biosynthesized by Ralstonia eutropha. Biomacromolecules, 2001, 2(4): 1285?1293.

    [10] Doi Y, Kanesawa Y, Kunioka M, et al. Biodegradation of microbial copolyesters: poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate). Macromolecules, 1990, 23(1): 26?31.

    [11] Mukai K, Doi Y, Sema Y, et al. Substrate specificities in hydrolysis of polyhydroxyalkanoates by microbial esterases. Biotechnol Lett, 1993, 15(6): 601?604.

    [12] S?hling B, Gottschalk G. Molecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway in Clostridium kluyveri. J Bacteriol, 1996, 178(3): 871?880.

    [13] Berg IA, Kockelkorn D, Buckel W, et al. A 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilation pathway in Archaea. Science, 2007, 318(5857): 1782?1786.

    [14] Hiramitsu M, Koyama N, Doi Y. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Alcaligenes latus. Biotechnol Lett, 1993, 15(5): 461?464.

    [15] Kunioka M, Kawaguchi Y, Doi Y. Production of biodegradable copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate by Alcaligenes eutrophus. Appl Microbiol Biotechnol, 1989, 30(6): 569?573.

    [16] Hein S, S?hling B, Gottschalk G, et al. Biosynthesis of poly(4-hydroxybutyric acid) by recombinant strains of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 1997, 153(2): 411?418.

    [17] Liu SJ, Steinbüchel A. A novel genetically engineered pathway for synthesis of poly(hydroxyalkanoic acids) in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(2): 739?743.

    [18] Efe C, Straathof AJJ, van der Wielen LAM. Options for biochemical production of 4-hydroxybutyrate and its lactone as a substitute for petrochemical production. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(6): 1392?1406.

    [19] Qiu YN. Overview of the production method and application of γ-butyrolactone (γ-BL). Sci-Tech Info Dev Econ, 2008, 18(34): 83?84.邱婭男. γ-丁內(nèi)酯的生產(chǎn)方法及其應(yīng)用綜述. 科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì), 2008, 18(34): 83?84.

    [20] Jing S, Guan LJ. Introduction about properties of 1,4-butanediol and processing technique. Chem Eng Equi, 2011(2): 137?138.景森, 關(guān)麗娟. 1,4-丁二醇性能及各種生產(chǎn)工藝介紹. 化學(xué)工程與裝備, 2011(2): 137?138.

    [21] Zhang L, Shi ZY, Wu Q, et al. Microbial production of 4-hydroxybutyrate, poly-4-hydroxybutyrate, and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by recombinant microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 84(5): 909?916.

    [22] Zhang YP, Huang ZH, Du CY, et al. Introduction of an NADH regeneration system into Klebsiella oxytoca leads to an enhanced oxidative and reductive metabolism of glycerol. Metab Eng, 2009, 11(2): 101?106.

    [23] Sánchez AM, Bennett GN, San KY. Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng, 2005, 7(3): 229?239.

    [24] Nielsen DR, Leonard E, Yoon SH, et al. Engineering alternative butanol production platforms in heterologous bacteria. Metab Eng, 2009, 11(4/5):262?273.

    [25] Heuser F, Schroer K, Lütz S, et al. Enhancement of the NAD(P)(H) pool in Escherichia coli for biotransformation. Eng Life Sci, 2007, 7(4): 343?353.

    [26] Li ZJ, Shi ZY, Jian J, et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metab Eng, 2010, 12(4): 352?359.

    [27] Yim H, Haselbeck R, Niu W, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4-butanediol. Nat Chem Biol, 2011, [Epub ahead of print].

    猜你喜歡
    丁二醇胞內(nèi)脫氫酶
    1,4-丁二醇加氫進(jìn)料泵管線改造
    科學(xué)家(2022年3期)2022-04-11 23:55:49
    食品接觸材料中1,4-丁二醇遷移量的測(cè)定
    云南化工(2021年5期)2021-12-21 07:41:30
    HIV/AIDS患者繼發(fā)鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群感染診療進(jìn)展
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:08
    人11β-羥基類固醇脫氫酶基因克隆與表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
    尿感方清除受感染膀胱上皮細(xì)胞胞內(nèi)尿道致病性大腸桿菌的作用
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:27
    姬松茸胞內(nèi)多糖和胞外多糖的抗氧化活性研究
    福建輕紡(2017年12期)2017-04-10 12:56:39
    聚丁二酸丁二醇酯/淀粉共混物阻燃改性的研究
    阻燃聚丁二酸丁二醇酯復(fù)合材料的制備及其阻燃性能研究
    乙醇脫氫酶的克隆表達(dá)及酶活優(yōu)化
    急性白血病患者乳酸脫氫酶水平的臨床觀察
    国产精品不卡视频一区二区 | 久久久久久久亚洲中文字幕 | 他把我摸到了高潮在线观看| 国产三级黄色录像| 日韩高清综合在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美激情国产日韩精品一区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 精品久久国产蜜桃| 欧美色视频一区免费| 一本精品99久久精品77| 国产视频一区二区在线看| 亚洲国产精品999在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产成人av教育| 看免费av毛片| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| 99视频精品全部免费 在线| 草草在线视频免费看| 超碰av人人做人人爽久久| 午夜激情福利司机影院| 韩国av一区二区三区四区| 一区二区三区高清视频在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 禁无遮挡网站| 亚洲在线观看片| 一区二区三区激情视频| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜激情福利司机影院| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 免费看美女性在线毛片视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 成人性生交大片免费视频hd| 人人妻人人看人人澡| 亚洲专区中文字幕在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲精华国产精华精| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲,欧美,日韩| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久国产乱子免费精品| 久久这里只有精品中国| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 69人妻影院| a在线观看视频网站| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲av不卡在线观看| 色av中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆| 男人和女人高潮做爰伦理| 听说在线观看完整版免费高清| 一级毛片久久久久久久久女| 我要看日韩黄色一级片| 日韩亚洲欧美综合| 91九色精品人成在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 综合色av麻豆| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲电影在线观看av| 久久久久久久久久黄片| 热99re8久久精品国产| 中文字幕av在线有码专区| 国产三级中文精品| 亚洲av熟女| 欧美黄色淫秽网站| 色尼玛亚洲综合影院| 一区二区三区四区激情视频 | 天天一区二区日本电影三级| 国产精品不卡视频一区二区 | 嫩草影院入口| 国产精华一区二区三区| 天堂网av新在线| 悠悠久久av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品91蜜桃| av天堂在线播放| 偷拍熟女少妇极品色| 性欧美人与动物交配| 伊人久久精品亚洲午夜| 97超视频在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产精品久久久久久久电影| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成年免费大片在线观看| av天堂中文字幕网| 久久久久久国产a免费观看| 51国产日韩欧美| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲av熟女| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲av电影在线进入| 麻豆av噜噜一区二区三区| 757午夜福利合集在线观看| eeuss影院久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产亚洲精品av在线| 国产野战对白在线观看| 成人无遮挡网站| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 搞女人的毛片| 久久久国产成人免费| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美zozozo另类| 成人特级av手机在线观看| 97碰自拍视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 精品久久久久久久末码| 青草久久国产| 精品久久久久久成人av| 亚洲久久久久久中文字幕| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲,欧美,日韩| 两个人的视频大全免费| 一a级毛片在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产高清视频在线观看网站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 好男人在线观看高清免费视频| 校园春色视频在线观看| 国产在线男女| av福利片在线观看| 性色avwww在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| av中文乱码字幕在线| 欧美日本视频| 一本综合久久免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国内精品久久久久久久电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 天天一区二区日本电影三级| 女人被狂操c到高潮| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲欧美清纯卡通| 成年免费大片在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 怎么达到女性高潮| 一本久久中文字幕| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 一本综合久久免费| 国产真实伦视频高清在线观看 | av在线天堂中文字幕| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美激情在线99| 国产久久久一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 国产一区二区在线av高清观看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产成人a区在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 宅男免费午夜| 日韩亚洲欧美综合| 丁香六月欧美| 久久热精品热| 长腿黑丝高跟| 久久午夜亚洲精品久久| 极品教师在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 两个人视频免费观看高清| 色播亚洲综合网| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产成人a区在线观看| 欧美区成人在线视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲av第一区精品v没综合| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 人妻久久中文字幕网| 欧美黑人欧美精品刺激| 日本免费一区二区三区高清不卡| 999久久久精品免费观看国产| 91av网一区二区| 五月玫瑰六月丁香| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久性视频一级片| 日韩欧美在线二视频| 特级一级黄色大片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 超碰av人人做人人爽久久| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 日韩av在线大香蕉| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产精品999在线| 日韩av在线大香蕉| 国产精品伦人一区二区| 99热6这里只有精品| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲五月天丁香| 内地一区二区视频在线| 久久久久久久久久成人| 中文字幕av成人在线电影| 麻豆国产97在线/欧美| 精品欧美国产一区二区三| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲精品456在线播放app | 久久人人爽人人爽人人片va | av天堂在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 日日夜夜操网爽| 久久精品国产自在天天线| 亚洲成人久久爱视频| 99久久九九国产精品国产免费| 精品久久久久久久久av| 国产成人啪精品午夜网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 久久性视频一级片| 波野结衣二区三区在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费av观看视频| 国产精品一及| 免费黄网站久久成人精品 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲 国产 在线| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲国产欧美人成| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美在线黄色| 夜夜夜夜夜久久久久| 永久网站在线| 成人无遮挡网站| 国产探花极品一区二区| 欧美性感艳星| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费高清视频大片| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产探花在线观看一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲不卡免费看| 午夜影院日韩av| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 嫩草影院新地址| 丁香六月欧美| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲第一电影网av| 热99在线观看视频| 女人被狂操c到高潮| 久久热精品热| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线a可以看的网站| 99国产综合亚洲精品| 脱女人内裤的视频| 免费电影在线观看免费观看| 又爽又黄a免费视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人av在线播放网站| av天堂中文字幕网| 性插视频无遮挡在线免费观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 美女免费视频网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 全区人妻精品视频| 久久午夜福利片| 日韩国内少妇激情av| a级毛片a级免费在线| 成人美女网站在线观看视频| 久久久久久久久久黄片| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩欧美精品v在线| 久久午夜亚洲精品久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久6这里有精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品久久久久久久久免 | av女优亚洲男人天堂| 亚洲av二区三区四区| 日本免费a在线| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久人人爽人人爽人人片va | 一区福利在线观看| 成年免费大片在线观看| av中文乱码字幕在线| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 一区二区三区免费毛片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av熟女| 久久久久久久久久成人| 嫩草影院精品99| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲18禁久久av| 国产大屁股一区二区在线视频| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品伦人一区二区| 一级a爱片免费观看的视频| 在线看三级毛片| 91字幕亚洲| 午夜精品久久久久久毛片777| 熟女电影av网| 久久九九热精品免费| 国产精品亚洲一级av第二区| a在线观看视频网站| 免费av不卡在线播放| 成人午夜高清在线视频| 成人国产综合亚洲| 毛片一级片免费看久久久久 | 两个人的视频大全免费| 99精品久久久久人妻精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美乱妇无乱码| 在线天堂最新版资源| 18美女黄网站色大片免费观看| 成年版毛片免费区| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费大片18禁| 在线观看舔阴道视频| 十八禁网站免费在线| 又爽又黄a免费视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲专区中文字幕在线| 午夜老司机福利剧场| 国产精品98久久久久久宅男小说| 69av精品久久久久久| 在线播放无遮挡| 91麻豆精品激情在线观看国产| 精品日产1卡2卡| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美性猛交黑人性爽| 两人在一起打扑克的视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 香蕉av资源在线| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利18| 亚洲国产精品成人综合色| 老女人水多毛片| 久久热精品热| 超碰av人人做人人爽久久| 中文字幕久久专区| 五月玫瑰六月丁香| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| eeuss影院久久| 99热这里只有是精品在线观看 | 99精品久久久久人妻精品| 亚洲成人免费电影在线观看| 97热精品久久久久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 极品教师在线免费播放| 亚洲成av人片在线播放无| 长腿黑丝高跟| 99热精品在线国产| 国产精品免费一区二区三区在线| 日本三级黄在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 99久久精品国产亚洲精品| 身体一侧抽搐| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 日韩高清综合在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av熟女| 国产熟女xx| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 99热这里只有是精品50| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲av免费在线观看| 国产成人啪精品午夜网站| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日本 av在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 黄色丝袜av网址大全| 国产私拍福利视频在线观看| 99热精品在线国产| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产淫片久久久久久久久 | 男人和女人高潮做爰伦理| 一区二区三区高清视频在线| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 88av欧美| 少妇的逼水好多| 国产精品女同一区二区软件 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 久久九九热精品免费| 一区二区三区高清视频在线| 两人在一起打扑克的视频| 搡老岳熟女国产| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 国产欧美日韩精品一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| .国产精品久久| 亚洲欧美清纯卡通| 中文字幕av成人在线电影| 久久99热6这里只有精品| 美女大奶头视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 97超视频在线观看视频| 国产av麻豆久久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲美女视频黄频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 精品久久国产蜜桃| 成人永久免费在线观看视频| 欧美黑人巨大hd| 床上黄色一级片| 一级黄片播放器| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 男女那种视频在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产午夜精品论理片| 亚洲国产精品成人综合色| 一区二区三区激情视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品久久久久久,| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一二三四社区在线视频社区8| 免费av观看视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲自偷自拍三级| netflix在线观看网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 精品不卡国产一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久国产乱子伦精品免费另类| 99久国产av精品| 一进一出好大好爽视频| 午夜视频国产福利| 欧美成人性av电影在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 一进一出抽搐动态| 男人舔女人下体高潮全视频| 成人美女网站在线观看视频| 18禁在线播放成人免费| 免费av不卡在线播放| 亚洲国产色片| 精华霜和精华液先用哪个| 一本精品99久久精品77| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲人成网站在线播| 国产欧美日韩一区二区三| 国产av麻豆久久久久久久| 51午夜福利影视在线观看| 久久国产精品影院| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 免费看美女性在线毛片视频| 国产老妇女一区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 精品久久久久久久久亚洲 | 两个人的视频大全免费| 中出人妻视频一区二区| 亚洲18禁久久av| 国产伦一二天堂av在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲avbb在线观看| 亚洲内射少妇av| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产精品999在线| 久久人妻av系列| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色日韩在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一区福利在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲欧美激情综合另类| 丰满的人妻完整版| 91在线观看av| 国模一区二区三区四区视频| 嫩草影视91久久| 日本三级黄在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 天堂网av新在线| 观看美女的网站| 国产午夜福利久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美zozozo另类| 国产高潮美女av| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品一区二区免费观看| 观看免费一级毛片| 天堂动漫精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久精品大字幕| 久久人人爽人人爽人人片va | 精品人妻1区二区| 国产69精品久久久久777片| 精品人妻视频免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 成人三级黄色视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久久成人免费电影| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产伦精品一区二区三区四那| 综合色av麻豆| 99久久99久久久精品蜜桃| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av五月六月丁香网| 久久午夜福利片| 动漫黄色视频在线观看| 午夜免费激情av| 91字幕亚洲| 高清在线国产一区| 亚洲最大成人av| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美黄色淫秽网站| 长腿黑丝高跟| 亚洲av二区三区四区| 免费在线观看亚洲国产| 精品乱码久久久久久99久播| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲片人在线观看| netflix在线观看网站| 亚洲五月婷婷丁香| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99热精品在线国产| 日本 欧美在线| 亚洲精品一区av在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 日本黄大片高清| 极品教师在线视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 小说图片视频综合网站| 国产成人欧美在线观看| 十八禁网站免费在线| 国产黄片美女视频| 久久99热6这里只有精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 日韩精品中文字幕看吧| 在线免费观看不下载黄p国产 | 一本一本综合久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 日韩欧美精品v在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲五月天丁香| 午夜影院日韩av| 99精品在免费线老司机午夜| 最近最新免费中文字幕在线| 午夜福利18| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人三级黄色视频| 成人精品一区二区免费| 男插女下体视频免费在线播放| 精品久久久久久久久亚洲 | 免费看a级黄色片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美成人a在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 美女被艹到高潮喷水动态| www.www免费av| 成人三级黄色视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精华一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美日本视频| 久久久色成人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜激情欧美在线|