煙酰胺腺嘌呤二核苷酸合成相關(guān)酶有助于1,4-丁二醇轉(zhuǎn)化為4-羥基丁酸

張?chǎng)?，陳?guó)強(qiáng)

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

4-羥基丁酸 (4-hydroxybutyrate，4HB) 作為神經(jīng)遞質(zhì)是 γ-氨基丁酸的代謝物，以很低的含量存在于哺乳動(dòng)物大腦中，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)領(lǐng)域里被認(rèn)為是一種神經(jīng)遞質(zhì)，對(duì)于自我平衡調(diào)整和產(chǎn)生有規(guī)律的睡眠等方面起著非常重要的作用[1]。4-羥基丁酸可經(jīng)氧化轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁岚肴㈢晁?，最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)而被代謝降解[2-3]。琥珀酸半醛脫氫酶缺陷的患者會(huì)在體液中積累很高濃度的 4-羥基丁酸，并表現(xiàn)出遲鈍、癲癇等癥狀[4]。4-羥基丁酸具有與鹽酸氯胺酮類似的麻醉效果，且能刺激體內(nèi)荷爾蒙素的分泌，因而被歸為管制藥品[5-6]。

4-羥基丁酸的另一常見用途是作為生物塑料聚3-羥基丁酸酯 4-羥基丁酸酯 (P3HB4HB) 的合成前體，它在共聚物中的比例直接影響著最終P3HB4HB的材料學(xué)性質(zhì)和降解性[7-11]。盡管 4-羥基丁酸可在厭氧菌克氏梭菌Clostridium kluyveri對(duì)乙醇、乙酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生[12]，也存在于古細(xì)菌勤奮金屬球菌Metallosphaera sedula等的 3-羥基丁酸/4-羥基丁酸固碳途徑中[13]，卻不能在羅氏真養(yǎng)菌 Ralstonia eutropha、大腸桿菌Escherichia coli等常用的PHA合成菌中形成。因此需要添加結(jié)構(gòu)相關(guān)碳源，如 4-羥基丁酸、γ-丁內(nèi)酯或者1,4-丁二醇作為4-羥基丁酸的來源[14-17]，這些添加物主要以石化產(chǎn)品為原料經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化制備[18-20]。

張磊等利用來源于惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida KT2442的醇脫氫酶 (DhaT) 和醛脫氫酶(AldD) 催化完成 1,4-丁二醇向 4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化[21]。這里DhaT和AldD的催化作用需要輔酶因子NAD的參與 (圖1)。

對(duì)輔酶因子的調(diào)節(jié)是代謝工程改造中的一個(gè)重要手段，提高胞內(nèi)NADH水平已成功用于促進(jìn)合成還原性產(chǎn)物如1,3-丙二醇[22]、琥珀酸[23]、丁醇[24]等。同理，提高胞內(nèi)NAD含量可能促進(jìn)1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化。煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 (Nicotinic Acid Phosphoribosyltransferase，PncB) 和NAD合成酶 (NAD Synthetase，NadE) 是大腸桿菌NAD合成途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，單獨(dú)表達(dá)時(shí)均使胞內(nèi)NAD (H)總量提高約 2.5倍，共表達(dá)時(shí)能夠提高近 7倍，且NAD增加量要多于 NADH增量[25]。因此，本研究通過在 E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中共表達(dá)pncB-nadE基因，提高1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌種Escherichia coli S17-1為清華大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒 pZL-dhaT-aldD由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建[21]。本文所用菌種、質(zhì)粒及引物序列見表1。

fastpfu DNA聚合酶以及用于基因克隆的E. coli DH5α為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。各種限制性內(nèi)切酶為Fermentas產(chǎn)品。質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒為博邁德公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

質(zhì)粒構(gòu)建過程以及搖瓶種子液均采用 LB培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為另外添加了10 g/L 1,4-丁二醇的 LB培養(yǎng)基。根據(jù)重組菌攜帶質(zhì)粒的抗性向滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中加入抗生素，其中氨芐青霉素濃度為100 mg/L，卡那霉素濃度為50 mg/L。

培養(yǎng)條件為37 ℃，200 r/min。除搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為48 h外，其余情況均培養(yǎng)12 h。

圖1 1,4-丁二醇向4-羥基丁酸的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig. 1 Conversion of 1,4-BD to 4HB.

表1 本研究中所使用的菌種、質(zhì)粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

1.3 NAD (H) 含量測(cè)定

按照已報(bào)道方法提取胞內(nèi)NAD和NADH[22]，略有修改。將3 mL搖瓶發(fā)酵菌液于4 ℃離心收集細(xì)胞，棄上清。將細(xì)胞用冰冷的去離子水洗滌2次后充分重懸于0.2 mL去離子水中。加入50 μL 0.4 mol/L HCl (提取NAD) 或者0.4 mol/L KOH (提取NADH)，充分混勻后在冰上放置10 min。NAD提取液在50 ℃水浴，NADH提取液在30 ℃水浴。10 min后迅速移到冰上加入50 μL 0.4 mol/L KOH (提取NAD) 或者0.4 mol/L HCl (提取NADH) 進(jìn)行中和。4 ℃、12 000 r/min離心10 min。上清液即為NAD (H) 的提取液，將其移至新的離心管中，立即檢測(cè)。

含量測(cè)定采用酶循環(huán)法，反應(yīng)體系為 (1 mL)：450 μL HEPES 緩沖液 (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，0.15 mol/L，pH 7.4)；200 μL 5-乙基吩嗪硫酸鹽 (PES，4 mg/mL)；200 μL噻唑藍(lán) (MTT，5 g/L)；50 μL乙醇；50 μL的600 U/mL乙醇脫氫酶 (ADH)。上述反應(yīng)液混勻后37 ℃溫育5 min，加入50 μL的NAD (H) 的提取液起始反應(yīng)。測(cè)定5 min內(nèi)OD570的變化。吸光度-時(shí)間曲線的斜率反應(yīng)出提取液中NAD (H) 的濃度。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞干重的測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后，12 000 r/min、10 min離心收集菌體，然后用去離子水洗滌、離心，去掉菌體表面粘附的培養(yǎng)基成分。將得到的細(xì)胞在抽真空條件下冰凍干燥至恒重，測(cè)定細(xì)胞干重 (Dry cell weight，DCW)。

1.4.2 產(chǎn)物濃度的測(cè)定

4-羥基丁酸的分析方法參考文獻(xiàn)[21]，取菌液離心后上清進(jìn)行冰干、酯化和氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pncB/nadE基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以E. coli MG1655基因組DNA為模板，表1中相應(yīng)引物用 fastpfu DNA聚合酶對(duì)基因 pncB和nadE進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，58 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸45/30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。

將pncB/nadE基因的PCR回收片段和表達(dá)載體pEn分別進(jìn)行 Sac Ⅰ/Xba Ⅰ酶切，連接后化學(xué)法轉(zhuǎn)入E. coli DH5α感受態(tài)中，陽性克隆經(jīng)EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ雙酶切，得到目的基因表達(dá)單元和載體骨架兩條帶 (圖2)，證明質(zhì)粒pEnpncB和pEnnadE構(gòu)建成功。再用Avr Ⅱ/Xho Ⅰ酶切pEnnadE，回收nadE表達(dá)單元一段，將其插入經(jīng)Nhe Ⅰ/Xho Ⅰ酶切的pEnpncB中，因?yàn)锳vr Ⅱ和Nhe Ⅰ是同尾酶，因此兩片段可相連得到質(zhì)粒pEnpncBnadE。經(jīng)Xba Ⅰ酶切驗(yàn)證正確后與質(zhì)粒 pZL-dhaT-aldD一起經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)入E. coli S17-1感受態(tài)，獲得重組菌株。已有報(bào)道，基于 pBBR1MCS2所構(gòu)建的質(zhì)粒能夠與pMD19-T Simple的衍生質(zhì)粒共存[26]，因此，這里的pZL-dhaT-aldD和 pEnpncBnadE能夠協(xié)同作用。進(jìn)一步質(zhì)粒提取證實(shí)了兩質(zhì)粒的相容性。

2.2 重組菌搖瓶發(fā)酵結(jié)果

以E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 為參照，驗(yàn)證PncB-NadE表達(dá)對(duì)1,4-丁二醇轉(zhuǎn)化的影響 (表2)。

野生型大腸桿菌也能由 1,4-丁二醇合成少量4-羥基丁酸，卻不能進(jìn)一步代謝利用 4-羥基丁酸[16,21,27]。另外，基因dhaT和 (或) aldD在嗜水氣假單胞菌 Aeromonas hydrophila 4AK4與 E. coli S17-1中顯示出相似的作用效果，而 A. hydrophila 4AK4 (pZL-dhaT-aldD) 的55 h發(fā)酵結(jié)果顯示4-羥基丁酸積累量不斷上升[21]?？赏茢郋. coli S17-1重組菌的 4-羥基丁酸積累量以及 1,4-丁二醇的消耗量在發(fā)酵過程中應(yīng)是逐漸增大的，因此，這里以48 h發(fā)酵后的結(jié)果作為討論依據(jù)。

對(duì)照組E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 由10 g/L的 1,4-丁二醇合成 4.31 g/L 4-羥基丁酸，轉(zhuǎn)化率(mol/mol%) 為36.44%。而同條件下，E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD，pEnpncBnadE) 則得到4.87 g/L 4-羥基丁酸，1,4-丁二醇的轉(zhuǎn)化率為 41.18%，比對(duì)照組提高13.03%。計(jì)算單位細(xì)胞量的4-羥基丁酸產(chǎn)率能夠更直接說明PncB-NadE的作用。對(duì)照組單位細(xì)胞產(chǎn)率為1.32 g/g，實(shí)驗(yàn)組相應(yīng)值為1.86 g/g。綜上結(jié)果，PncB-NadE的共表達(dá)明顯促進(jìn)4-羥基丁酸的合成。

盡管如此，仍有近60%的1,4-丁二醇未被利用，這是因?yàn)榇济摎涿?(DhaT) 對(duì)1,4-丁二醇活性不高，且發(fā)酵后期會(huì)進(jìn)一步減弱[21]，所以，需要篩選出更有效的酶來催化反應(yīng)以充分利用1,4-丁二醇。

此外，PncB-NadE的表達(dá)同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞干重下降?？赡苁且?yàn)榘麅?nèi)NAD的增加導(dǎo)致氧化還原態(tài)失衡，影響了細(xì)胞的正常代謝。細(xì)胞總量減少是轉(zhuǎn)化率不能充分提高的另一原因，可通過添加葡萄糖等有利碳源來刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，進(jìn)而增加 1,4-丁二醇利用率。

圖2 質(zhì)粒pEnpncB、pEnnadE、pEnpncBnadE的酶切圖譜Fig. 2 Characterization of pEnpncB, pEnnadE, pEnpncBnadE. M: 1 kb DNA marker; p: pEnpncB digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 532 bp and 2 706 bp; n: pEnnadE digested with EcoR I/Xho I, two brands were 1 173 bp and 2 706 bp; pn: pEnpncBnadE digested with Xba I, two brands were 1 155 bp and 4 238 bp.

表2 重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)4-羥基丁酸Table 2 Production of 4-hydroxybutyric acid by E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE) and E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)

2.3 NAD (H) 含量測(cè)定

酶循環(huán)反應(yīng)中吸光度-時(shí)間曲線的斜率正比于提取液中 NAD (H) 的濃度。結(jié)果證明 PncB-NadE的表達(dá)確實(shí)能提高胞內(nèi)NAD (H) 濃度 (圖3)。結(jié)合表2計(jì)算單位質(zhì)量細(xì)胞內(nèi)NAD和NADH含量變化，E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD，pEnpncBnadE) 比E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD) 中NAD和NADH含量分別提高2.04倍和2.74倍。

圖3 重組菌NAD (H) 含量測(cè)定Fig. 3 Relative concentration of NAD (H) in different recombinants. 1: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 2: NAD (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)); 3: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD, pEnpncBnadE)); 4: NADH (E. coli S17-1 (pZL-dhaT-aldD)).

3 結(jié)論

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本次計(jì)算中取泊松比為υ=0.35，Ib=0.7，rm=12.5。室內(nèi)試驗(yàn)測(cè)得的主固結(jié)完成后的剪切模量為G=0.664 MPa。

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