微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)及分子改造研究進(jìn)展

劉松，張東旭，堵國成，陳堅

江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的表達(dá)及分子改造研究進(jìn)展

劉松，張東旭，堵國成，陳堅

江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶具有催化蛋白質(zhì)和某些非蛋白物質(zhì)交聯(lián)的功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及紡織等領(lǐng)域。為提高該酶的產(chǎn)量及建立相應(yīng)的分子改造平臺，上世紀(jì)90年代日本味之素公司便開展了微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶重組菌構(gòu)建的研究。目前，該酶已在多個表達(dá)系統(tǒng)中實現(xiàn)活性表達(dá)，部分重組菌較野生菌的產(chǎn)酶能力有顯著提高。近年來，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的分子改造研究也取得了初步進(jìn)展，酶的催化活力、熱穩(wěn)定性及底物專一性得到提升。文中對上述研究中涉及的蛋白質(zhì)表達(dá)及改造策略進(jìn)行了簡要的總結(jié)及分析，并指出相關(guān)研究的發(fā)展趨勢。

鏈霉菌，谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，蛋白質(zhì)表達(dá)，分子改造，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

TGase最初從動物[3]和植物組織[4]中提取，產(chǎn)量低，分離成本高。1989年，日本味之素公司首次在土壤中分離到 TGase生產(chǎn)菌株，茂原鏈輪絲菌Streptoverticillium mobaraense S-8112[5]。此后，研究者不斷分離到新的TGase生產(chǎn)株菌，包括拉達(dá)克輪絲菌 Streptoverticillium ladakanum[6]，吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus[7]，環(huán)狀芽胞桿菌Bacillus circulans[8]，枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis[9]等。與其他來源的TGase相比，微生物發(fā)酵生產(chǎn)的TGase具有非Ca2+依賴性的特點，且生產(chǎn)周期短，成本優(yōu)勢明顯。目前，鏈霉菌TGase已廣泛用于食品工業(yè)，適量添加TGase可顯著改善各類食品蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和營養(yǎng)價值，應(yīng)用范圍包括肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、植物蛋白制品等[1]。此外，TGase在一些非食品工業(yè)領(lǐng)域也具有較大的應(yīng)用前景，如組織工程、紡織工業(yè)及生物學(xué)研究等[2]。然而，依靠優(yōu)勢菌種選育和過程優(yōu)化[10-11]的傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)對TGase產(chǎn)量的提高十分有限，遠(yuǎn)不能滿足市場需求。

為進(jìn)一步提高產(chǎn)量，日本味之素公司率先開展了 TGase重組菌構(gòu)建的工作。隨后，德國Martin-Luther University、臺灣食品工業(yè)發(fā)展研究所、臺灣國立中興大學(xué)、中科院微生物研究所、華南理工大學(xué)及諾和諾德 (中國) 制藥有限公司等相關(guān)研究機(jī)構(gòu)或企業(yè)相繼報道了重組TGase的制備策略。至此，鏈霉菌TGase已在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌及谷氨酸棒桿菌等宿主中成功表達(dá)(表1)。其中，重組谷氨酸棒桿菌胞外TGase活力達(dá)到16.3 U/mL[12]，遠(yuǎn)高于野生菌發(fā)酵產(chǎn)酶水平[10]。然而，特有的催化性能[1]及活化機(jī)制[13]使鏈霉菌TGase在異源宿主中的高效表達(dá)遇到諸多問題，如，低表達(dá)量、易形成包涵體及無催化活性等。本文對上述研究中涉及的蛋白質(zhì)表達(dá)策略進(jìn)行了簡要的分析，并總結(jié)了TGase分子改造研究的最新進(jìn)展，旨在為微生物 TGase的后續(xù)研究及具有類似活化機(jī)制的功能蛋白或酶類[14]的表達(dá)與改造提供參考。

1 重組TGase表達(dá)

如圖2所示，鏈霉菌TGase是一種胞外酶，以無活性的酶原 (pro-TGase) 形式分泌，pro-TGase被切除N-端酶原區(qū)后，轉(zhuǎn)化成活性TGase[15]。在分泌過程中，金屬蛋白酶 (TAMEP) 及絲氨酸蛋白酶參與了TGase的活化[13,16]。鏈霉菌TGase基因的完整讀碼框由信號肽基因、酶原區(qū)基因及成熟酶基因組成[6,15,17-19]?；诖?，TGase表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建圍繞TGase及pro-TGase的表達(dá)進(jìn)行，歷經(jīng)了TGase非活表達(dá)及活性表達(dá)兩個階段。

圖1 TGase催化反應(yīng)[1]Fig. 1 The catalytic reactions mediated by TGase[1].

表1 鏈霉菌TGase在異源體系中的表達(dá)Table 1 Expression of Streptomyces TGase in heterogeneous system

圖2 鏈霉菌pro-TGase活化機(jī)制[13]Fig. 2 The mechanism of pro-TGase activation[13].

1.1 TGase的非活性表達(dá)

1.1.1 表達(dá)TGase成熟酶

表達(dá)TGase成熟酶基因是獲得重組TGase最直接的方法。在大腸桿菌中，N-端融合信號肽的TGase可分泌至周質(zhì)空間，但是蛋白表達(dá)量極低，且比酶活力遠(yuǎn)低于野生酶[20]。而換用強(qiáng)啟動子[21]、N-端融合表達(dá)增強(qiáng)序列[21]以及密碼子偏好性優(yōu)化[22]雖可提高表達(dá)量，但TGase基本以包涵體形式存在。使用受嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控的T7啟動子仍無法解決TGase成熟酶在大腸桿菌中的可溶性問題[27]。令人意外的是，雖然TGase成熟酶在酵母中成功分泌至胞外，卻無法獲得催化活性[26]。因此，上述重組TGase需經(jīng)過體外復(fù)性才能獲得催化活性。傳統(tǒng)的稀釋法復(fù)性得到的TGase比酶活力可達(dá)到野生酶的水平，總酶活力收率達(dá)到50%[34]?！半p梯度 (脲濃度與pH) 上柱復(fù)性”同樣可成功復(fù)性 TGase[27]。然而，蛋白復(fù)性的高成本不利于TGase工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。

1.1.2 表達(dá)pro-TGase

與TGase成熟酶的表達(dá)不同，各鏈霉菌來源的pro-TGase均可在大腸桿菌中高效可溶表達(dá)[28,30]。采用葡萄糖流加策略進(jìn)行重組菌的高密度發(fā)酵，pro-TGase產(chǎn)量顯著提高[31]。結(jié)果表明，TGase酶原區(qū)的存在可能提高了 TGase在大腸桿菌中的溶解性。同樣，pro-TGase亦可在鏈霉菌、酵母及棒桿菌中高效可溶表達(dá)。在變鉛青鏈霉菌 Streptomyces lividans 66中，pro-TGase在自身啟動子及信號肽介導(dǎo)下即可高效分泌[23]。以酵母或棒桿菌為宿主時，pro-TGase則需在N-端融合宿主信號肽才能被分泌至胞外[26,29]。強(qiáng)化pro-TGase分泌的策略有2種：1) 修飾 pro-TGase酶原區(qū)；2) 優(yōu)化信號肽與宿主菌的組合。前者可使pro-TGase分泌量提高25%[12]，后者得到的胞外pro-TGase可達(dá)到2 500 mg/L，是目前報道的最高水平[29]。

Pro-TGase表達(dá)后需經(jīng)切除酶原區(qū)后才能轉(zhuǎn)化成活性TGase。用于pro-TGase活化的蛋白酶可從產(chǎn)TGase的野生菌 (如 Sv. mobaraense分泌的TAMEP[35]) 或其他鏈霉菌 (如白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus分泌的 SAM-P20、SAM-P26及 SAM-P45等[23]) 中提取。一些商品化的蛋白酶亦能活化pro-TGase，如中性蛋白酶及胰蛋白酶等[36]。然而，活化反應(yīng)體系中殘存的蛋白酶活力可能持續(xù)降解活性TGase，不利于其保存和應(yīng)用[36]。為消除蛋白酶存留的不利影響，采用“上柱激活”的方法可將殘余的活化蛋白酶與TGase分離，TGase貯存穩(wěn)定性顯著提高[31]。

1.2 TGase的活性表達(dá)

1.2.1 選擇適宜的宿主

在多數(shù)表達(dá)宿主中，TGase需要其酶原的輔助才能高效可溶表達(dá)。然而，特定的宿主環(huán)境似乎可以消除 TGase對酶原區(qū)的這種依賴。最新的報道表明，在肉桂鏈輪絲菌 Streptoverticillium cinnamoneum磷脂酶D (PLD) 啟動子及其信號肽的介導(dǎo)下 Sv. cinnamoneum TGase成熟酶基因可在 S. lividans 1326中高效表達(dá) (230 mg/L)，產(chǎn)物分泌至胞外且比酶活力與野生酶相當(dāng)[33]。

選用分泌活化蛋白酶的宿主表達(dá) pro-TGase是直接生產(chǎn)活TGase的另一種方式。已發(fā)現(xiàn)具有TGase活化蛋白酶的宿主主要是鏈霉菌，包括 S. lividans3113[19]及 S. lividans JT46[6]。其中，以 S. lividans JT46為表達(dá)宿主時，TGase的活性表達(dá)較為成功。Sv. ladakanum[6]及平板鏈霉菌 Streptomyces platensis[18]來源的 pro-TGase在其內(nèi)源啟動子及信號肽的作用下均可分泌至胞外；前者只有部分轉(zhuǎn)化為活性 TGase (1.46 U/mL) 而后者則完全活化(2.2 U/mL)?；罨实牟町惪赡苁怯捎趐ro-TGase氨基酸序列不同導(dǎo)致的，后者的酶原區(qū)切割位點可能更易于被宿主蛋白酶所識別。因此，在酶原區(qū)與TGase成熟之間引入宿主蛋白酶特異性切割位點有望提高活性TGase的產(chǎn)量。事實上，在酶原區(qū)C-端加入酵母 Kex2肽鏈內(nèi)切酶識別位點后，pro-TGase在酵母中表達(dá)后可直接轉(zhuǎn)化成活性 TGase[26]。值得注意的是，將 pro-TGase克隆至原始菌株中表達(dá)，借助其野生活化系統(tǒng)進(jìn)行活化是一種提高TGase產(chǎn)量的有效方式[17]。

1.2.2 共表達(dá)活化蛋白酶

與其他表達(dá)策略相比，在無活化蛋白酶的宿主中共表達(dá) pro-TGase及其活化蛋白酶得到活性TGase產(chǎn)量最高。在谷氨酸棒桿菌中共表達(dá)分別融合分泌信號肽的SAM-P45及pro-TGase，大量活性TGase即可分泌至胞外[24]；改造酶原區(qū)C-端后，該體系即可得到帶有天然N-端的TGase[25]。此外，共表達(dá)人鼻病毒3C蛋白酶及加入3C蛋白酶識別位點的 pro-TGase同樣可在大腸桿菌中直接得到活性TGase[32]。然而，共表達(dá)體系產(chǎn)生的活化蛋白酶存在持續(xù)降解活性TGase的可能[24]，同時蛋白酶活力對TGase產(chǎn)品的應(yīng)用也將造成不利影響。

1.2.3 共表達(dá)酶原區(qū)

如前所述，在表達(dá)過程中酶原區(qū)對TGase的可溶性及催化活性有輔助作用。這種輔助作用可通過分子內(nèi)相互作用來完成，即表達(dá)pro-TGase；也可通過分子間相互作用實現(xiàn)，即共表達(dá)酶原區(qū)與 TGase成熟酶。共表達(dá)酶原區(qū)與TGase成熟酶的一個重要優(yōu)勢是無需活化蛋白酶參與即可得到活性 TGase，可避免共表達(dá)活化蛋白酶的不利影響。到目前為止，該策略只在酵母系統(tǒng)中成功實施[26]。

2 TGase分子改造

基因水平上的分子改造需要易于操作的蛋白表達(dá)系統(tǒng)及準(zhǔn)確可行的檢測方法。應(yīng)用于TGase分子改造的表達(dá)系統(tǒng)主要是大腸桿菌[28,32]及谷氨酸棒桿菌系統(tǒng)[37]。適于突變體篩選的TGase活力檢測方法包括三肽為底物的顯色法[37]、可定量檢測大分子交聯(lián)反應(yīng)的基于酶標(biāo)技術(shù) (ELT) 的核磁共振法[38]及鄰近閃爍分析法 (SPA) 等[32]。此外，應(yīng)用反向HPLC檢測蛋白濃度的技術(shù)為TGase比酶活力分析提供了快速可靠的方法[37]。目前，分子改造主要以茂原鏈霉菌Streptomyces mobaraensis (即Sv. mobaraense)來源的TGase為研究對象。

2.1 理性設(shè)計

2.1.1 基于分子柔性區(qū)域分析的定點突變

異核單量子相干譜 (HSQC) 可檢測酶分子中特定區(qū)域氨基酸缺失或突變對催化活性中心構(gòu)象的影響；若缺失或突變未導(dǎo)致酶分子錯誤折疊但改變了催化活性中心的構(gòu)象，則表明該區(qū)域具有一定的柔韌性，可作為分子改造的目標(biāo)區(qū)域[39]。研究發(fā)現(xiàn)，N-端缺失第一個氨基酸 (Asp) 的 TGase (Ser-TGase) 較野生酶具有更高的催化活力[38]?；诖?，通過HSQC確定N-端是TGase的一個柔性區(qū)域。實驗表明，適度缺失及取代突變N-端氨基酸殘基均可提高TGase的催化活性[39]。該方法可對晶體結(jié)構(gòu)未知的酶分子進(jìn)行理性改造，但柔性區(qū)域的檢測仍具有偶然性，需要一定的前期研究基礎(chǔ)。

2.1.2 基于水接觸表面熱點區(qū)域的定點突變(WASH-ROM)

WASH-ROM 認(rèn)為，酶分子中具有高溶劑觸表面積 (SAS) 且與催化活性中心臨近的氨基酸殘基可能影響酶與底物的接觸，通過突變這些氨基酸可強(qiáng)化酶與底物的接觸，從而提高其催化活性[37]。在TGase分子的改造過程中，利用生物信息學(xué)軟件，如Discovery Studio (Accelrys Software Inc.)，計算出離TGase催化活性中心15?以內(nèi)的90個氨基酸殘基的相對SAS，選取其中40個具有高相對SAS的氨基酸殘基分別進(jìn)行1~6種氨基酸的單點取代[37]，得到的突變體最高比酶活力達(dá)到41.7 U/mg，是野生TGase比活力的1.5倍。該改造策略較前者更高效，但必須已知酶分子的晶體結(jié)構(gòu)。

2.2 定向進(jìn)化

理性設(shè)計改造TGase的突變體篩選工作量少，但其理論依據(jù)仍然有限。隨機(jī)突變的篩選工作量大，但可以對TGase多方面的催化性能進(jìn)行改造，如熱穩(wěn)定性、熱敏性及催化活力等。定向進(jìn)化改造TGase的關(guān)鍵是建立突變庫高通量篩選方法。以大腸桿菌表達(dá)體系為篩選平臺時，細(xì)胞破碎、TGase的活化及酶活力檢測均在多孔板上完成[40]。通過隨機(jī)突變，正突變體的熱穩(wěn)定性達(dá)到野生TGase的2.7倍，而熱敏性突變體則只保留了10 ℃~40 ℃間的催化活性[40]。以谷氨酸棒桿菌為篩選平臺時，TGase突變體基本分泌至胞外，無需細(xì)胞破碎及 TGase活化即可在多孔板上完成活性的篩選，工作效率顯著提高；所得 TGase正突變體最高比活力達(dá)到42.9 U/mg，是野生酶的1.7倍[37]。

2.3 理性設(shè)計與定向進(jìn)化的結(jié)合

理性設(shè)計與隨機(jī)突變結(jié)合的基本思想是，根據(jù)已知數(shù)據(jù)和知識選擇酶分子特定區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，在不影響突變效果的前提下降低突變庫的規(guī)模，可顯著提高分子改造的效率。改造TGase底物專一性的同時，發(fā)現(xiàn)N-端帶有額外Gly及Pro的TGase (Gly-Pro-TGase) 對人類生長因子 Gln141催化作用較野生TGase具有更高的專一性[32]；晶體結(jié)構(gòu)分析表明Tyr62及Tyr75可能影響TGase的催化活力，且兩者的取代突變 (Tyr62His及 Tyr75Phe) 可提高TGase對 Gln141的專一性。基于此，對 Gly-Pro-TGase中Tyr62及Tyr75分別進(jìn)行17種及12種氨基酸取代，構(gòu)建飽和突變庫，最終篩選得到5個TGase突變體對Gln141具有高度專一性[32]。

2.4 TGase的結(jié)構(gòu)與功能

晶體結(jié)構(gòu)顯示 (圖3)，S. mobaraense TGase的二級結(jié)構(gòu)屬于α+β型，含11個α-螺旋及8個β-折疊；分子總體呈盤狀并帶有一個裂縫，兩個loop環(huán)(Asp1-Ala10與Asn276-Met288) 組成裂縫左壁，一個loop環(huán) (Asn239至Asn253) 組成裂縫右壁；催化活性基團(tuán)Cys64、Asp255及His274均位于分子裂縫底部[41]。隨著分子改造研究的推進(jìn)，TGase分子中影響酶學(xué)性質(zhì)的重要結(jié)構(gòu)區(qū)域得到初步揭示，包括：

1) 分子裂縫的左壁區(qū)域。該區(qū)域中N-端 loop環(huán)的修飾對 TGase催化性質(zhì)有較大影響。適度缺失 N-端氨基酸殘基 (1~3個) 可提高 TGase的催化效率[39]。這可能是由于氨基酸的缺失降低了底物與催化活性中心接觸的空間位阻。N-端緊靠裂縫的氨基酸取代 (Ser2Arg等)[39]及位于分子表面的極性氨基酸取代 (Ala10Ser等)[37]或酸性氨基酸取代(如，Glu28Asp等)[37]均可提高TGase的催化活性。此外，N-端的單點突變還可提高 (Ser2Phe等) 或降低 (Pro9Leu等) TGase的熱穩(wěn)定性[40]。

2) 分子表面與裂縫臨近區(qū)域。該區(qū)域包括盤狀分子的正面及背面。分子正面 (Gln74Ala等) 及背面 (Ser299Phe等) 的疏水性氨基酸取代突變提高了TGase催化活性[37]。而位于分子正面與裂縫臨近的Tyr62及Tyr75的取代突變還可顯著提高TGase的底物專一性[32]。

圖3 S. mobaraense TGase晶體結(jié)構(gòu) (正面)[41]Fig. 3 Crystal structure of S. mobaraense TGase (front view)[41].

3) 分子內(nèi)部與催化活性基團(tuán)臨近的區(qū)域。與催化活性基團(tuán) Asp25臨近的Gly257Ser與 Lys269Glu可增強(qiáng)TGase的熱穩(wěn)定性[40]。分子內(nèi)部的疏水性氨基酸取代 (Tyr42Phe及Ser199Ala) 對催化活性也有較大影響[37]。值得注意的是，N-端若添加Phe-Arg-Ala-Pro使 Ser199Ala的催化活性進(jìn)一步提高[37]，體現(xiàn)了在酶活力調(diào)節(jié)過程中該區(qū)域與N-端區(qū)域的協(xié)同效應(yīng)。突變體的晶體結(jié)構(gòu)分析將有助于解釋這種效應(yīng)。

最近，分子對接實驗 (Molecular docking) 已模擬出TGase與底物的結(jié)合方式[42]。合成小分子底物CBZ-Gln-Gly在TGase分子裂縫中被拉伸，活性位點通過疏水相互作用與底物結(jié)合；當(dāng)TGase與大分子底物 (酪蛋白等) 結(jié)合時，TGase的底物識別位點將在分子裂縫表面進(jìn)一步擴(kuò)展，體現(xiàn)了微生物TGase對底物的適應(yīng)性?？傊瑢Gase結(jié)構(gòu)與功能的深入了解將有助于探測分子改造的靶點，提高改造效率。

3 總結(jié)與展望

大量的研究表明，鏈霉菌TGase在多數(shù)異源宿主中高效可溶表達(dá)需要其酶原區(qū)的輔助，這種輔助作用的本質(zhì)是對TGase折疊進(jìn)行不同性質(zhì)的抑制。在大腸桿菌系統(tǒng)中，酶原區(qū)抑制TGase無序折疊產(chǎn)生包涵體；在酵母表達(dá)體系中，抑制TGase錯誤折疊產(chǎn)生無活性蛋白；在棒桿菌中，酶原區(qū)則抑制TGase快速折疊從而促進(jìn)其分泌。最近 pro-TGase的晶體結(jié)構(gòu)[43]已經(jīng)公布，為進(jìn)一步分析酶原區(qū)的功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。在已有的表達(dá)策略中，共表達(dá)TGase成熟酶及其酶原區(qū)較其他表達(dá)策略具有明顯優(yōu)勢，是實現(xiàn)重組TGase工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的重要途徑。在某些宿主中TGase無需酶原區(qū)亦可高效分泌，因此，篩選可直接分泌表達(dá)TGase成熟基因的宿主及信號肽同樣應(yīng)受到重視。

目前，微生物TGase分子改造的研究大部分以提高TGase的催化效率及熱穩(wěn)定性為目標(biāo)，對其底物專一性的改造則關(guān)注較少。事實上，微生物TGase對底物具有較高的專一性。底物篩選實驗表明，底物中谷氨酰胺殘基的臨近氨基酸組成[44-45]以及伯胺的鏈長[46-47]均對微生物 TGase催化反應(yīng)有重要影響。隨著微生物TGase應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，底物分子的多樣性與TGase底物專一性的矛盾將日漸突出。因此，將來一個時期，在提高TGase環(huán)境穩(wěn)定性的同時，應(yīng)更加注重對TGase底物專一性的改造。近年來，理性設(shè)計與定向進(jìn)化相結(jié)合的分子改造技術(shù)不斷發(fā)展，如重復(fù)飽和突變 (ISM) 及組合活性位點飽和突變 (CASTing) 等[48]，將為TGase的改造提供有力工具。

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Progress in expression and molecular modification of microbial transglutaminase

Song Liu, Dongxu Zhang, Guocheng Du, and Jian Chen
Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

Microbial transglutaminase, which could catalyze the cross-linking of many proteins or non-protein materials, has been widely used in food, pharmaceutical and textile industry. To enhance the yield of the enzyme and establish corresponding platform for molecular modification, the researchers of Japanese Ajinomoto began to construct the recombinant strain producing transglutaminase in the 1990s. So far, the enzyme has been successfully expressed in different expression systems. Some of the recombinant strains are more productive than wild strains. Recently, progress has been made in the molecular modification of microbial transglutaminase, and the activity, thermo-stability and specificity of the enzyme are improved. This review briefly summarized and analyzed the strategies involved in these studies, and noted its trends.

Streptomyces, transglutaminase, protein expression, molecular modification, protein structure

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶 (Transglutaminase，EC 2.3.2.13， TGase)，能夠催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷氨酰胺殘基的 γ-羧酰胺基與各種?；荏w發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，形成 ε-(γ-谷氨酰基) 賴氨酸共價鍵。根據(jù)酰基受體不同，TGase催化反應(yīng)分3類：1) 交聯(lián)反應(yīng)：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基作為?；荏w時，催化形成的ε-(γ-谷氨?；? 賴氨酸共價鍵導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu) (圖1a)；2) 連接反應(yīng)：當(dāng)伯胺作為酰基受體時，催化形成的 ε-(γ-谷氨酰基)賴氨酸共價鍵使游離的伯胺與蛋白質(zhì)連接 (圖1b)；3)脫酰胺：當(dāng)不存在伯胺時，水成為?；荏w，TGase催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基脫去氨基生成谷氨酸殘基 (圖1c)[1-2]。

May 4, 2011; Accepted: September 16, 2011

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 31000031, 31171639), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2011AA100905), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2010147).

Guocheng Du. Tel/Fax: +86-510-85918309; E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31000031, 31171639)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2011AA100905)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK2010147) 資助。