激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)促進腦缺血后血管新生的機制

趙曉霞， 宋春伶

腦缺血后的神經(jīng)、血管調(diào)節(jié)機制較為復(fù)雜，其中激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)起重要作用。它主要通過具有血管活性的激肽與其特異受體結(jié)合，影響一系列因子及細胞，發(fā)揮擴血管，神經(jīng)保護，促進局部血管新生和神經(jīng)再生的作用，從而促進神經(jīng)功能的改善。本文總結(jié)了激肽釋放酶一激肽系統(tǒng)促進新血管生成的多種機制，為缺血性卒中的治療提供新的思路。

1 激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的成員

激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(KKS)包括6個成員:激肽釋放酶、激肽釋放酶抑制劑、激肽原、激肽、激肽受體、激肽酶。激肽原分為高分子量激肽原(HK)和低分子量激肽原(LK)。激肽釋放酶是該系統(tǒng)的核心成分的，也是主要的調(diào)控分子，為Abelous等于1909年首次發(fā)現(xiàn)并報道，它是絲氨酸蛋白酶超家族成員，根據(jù)其合成部位、分布、作用底物、免疫學(xué)特征、降解產(chǎn)物和生物學(xué)功能等的不同，激肽釋放酶又分為組織型激肽釋放酶(Tissue Kallikrein，TK)和血漿型激肽釋放酶(Plasma kallikrein，PK)2種。PK為單基因編碼，該基因位于4q35染色體上，由15個外顯子14個內(nèi)含子組成，它主要在肝臟合成，分布于血漿中，可裂解HK釋放出九肽的緩激肽;TK基因位于染色體19q13.4，包括261～558 bp，由15個激肽釋放酶基因組成。它分布于腎、唾液腺、胰腺、腦和心血管，裂解LK生成十肽的胰激肽，又稱血管舒張素，后者在氨基肽酶的作用催化下失去賴氨酸，成為緩激肽。緩激肽與胰激肽統(tǒng)稱為激肽。激肽是主要的效應(yīng)分子，它與血管內(nèi)皮激肽受體結(jié)合而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。激肽受體為G蛋白偶聯(lián)受體，主要有2種:B1受體和B2受體，B2受體于正常機體中存在，是與激肽結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng)的主要受體;B1受體為損傷誘導(dǎo)型受體，當機體處于缺血、炎癥等損傷狀態(tài)時大量生成以發(fā)揮改善循環(huán)等作用［1］。激肽釋放酶抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一個成員，能與激肽釋放酶結(jié)合成熱穩(wěn)定的復(fù)合物而抑制其功能。

2 激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的促進血管生成的作用及機制

KKS腦缺血時發(fā)揮多種作用以促進神經(jīng)功能的恢復(fù)，如擴血管改善循環(huán)，促進血管新生，加強神經(jīng)再生［2］，神經(jīng)保護作用［3］，抑制血管內(nèi)皮增厚、降血壓［4］等。其中，血管再生是腦組織發(fā)生缺血后所誘發(fā)的一種自我保護機制，可改善缺血區(qū)周圍的血流供應(yīng)，為腦組織重建提供充足的養(yǎng)分和營養(yǎng)。胡湘蜀等用熒光劑注入股靜脈的方法檢測大鼠腦組織的血管密度，得出結(jié)論:缺血周圍區(qū)域血管密度較非缺血半球相應(yīng)區(qū)域明顯增加，梗死半球半暗帶區(qū)域血管數(shù)量有所增加，主支血管上出現(xiàn)較大的小血管盲端為新血管形成跡象［5］。另有研究通過磁共振T2加權(quán)序列也發(fā)現(xiàn)動物腦組織缺血后4w開始出現(xiàn)血管增生的現(xiàn)象［6］。因此這就為我們治療缺血性腦血管病提供了新的思路，也是目前尚需進一步研究的課題。在一般情況下，新血管的形成被稱為血管新生，其中包括血管再生、動脈形成和血管生成。血管再生是指新的毛細血管從現(xiàn)有的微血管出芽生成新的血管;動脈形成過程中是指有足夠的直徑的血管成熟的過程，通過誘導(dǎo)單核細胞聚集并促進新血管形成來實現(xiàn);而血管生成是內(nèi)皮前體細胞的分化及成熟所介導(dǎo)的血管形成過程。血管生成因子和血管再生相關(guān)細胞是新的血管形成的兩個因素。

2.1 血管生成因子

2.1.1 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) VEGF是一個有效地促血管生成因子，它是分子量介于34000～45000Da之間的糖基化二聚體。體內(nèi)許多細胞都可分泌VEGF，它的調(diào)節(jié)是通過多種細胞因子實現(xiàn)的，如白介素-1β(IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)等，它參與內(nèi)皮細胞的增殖、分化和毛細血管的形成。人類VEGF基因位于染色體6p21.3，至少有 5種表型(VEGF121，VEGF145，VEGF165，VEGF189和 VEGF206)。VEGF與其受體(以VEGFR2為主)結(jié)合后誘導(dǎo)微血管滲漏、內(nèi)皮細胞增殖、浸潤、分化和存活［7］。有實驗表明，由重組腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的VEGF的過度表達可顯著激活血管再生，同時增加成年大鼠血腦屏障的滲漏［8］。先前有報道說，VEGF可被緩激肽超激活，隨之激活內(nèi)皮細胞上的eNOS［9，10］以發(fā)揮促血管生成的作用。經(jīng)流式細胞儀檢測，HK可明顯增加VEGF的水平，還誘導(dǎo)VEGFR-2的表達少量但顯著增高。首先，激肽與B2受體結(jié)合后通過磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B--糖原合酶激酶-3β信號通路 (phosphoimsitide 3 kinase-Akt-glycogen synthase kinase-3β pathway，PI3K-Akt-GSK-3β)增加 VEGF 和 VEGFR2在血管內(nèi)皮細胞上的表達，抑制B2受體的激活，則阻礙了激肽釋放酶對血管網(wǎng)生成和內(nèi)皮細胞遷移的作用［11］。此外，激肽B1受體在血管再生中的作用可能是由VEGF介導(dǎo)的［12］。

2.1.2 血管生成素(Angiopoietins) 血管生成素也是血管重塑的過程中關(guān)鍵因子，促進平滑肌細胞和周細胞聚集。其中最重要的是Ang-1和Ang-2，它們均與Tie2受體結(jié)合，但作用不同。Ang-1促進內(nèi)皮細胞存活和血管成熟［13］，降低血管通透性［14］，增加血管的穩(wěn)定性。Ang-2抑制Ang-1的穩(wěn)定性和成熟，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞/周細胞之間的連接變得疏松，因而使血管的可塑性增強。Ang-2促進VEGF誘導(dǎo)的血管生成，并且增加基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達。Ang-2與VEGF協(xié)同作用時促進血管再生，而當缺乏VEGF時則導(dǎo)致內(nèi)皮細胞死亡和血管退化。KKS可使eNOS上調(diào)，NO釋放增多，經(jīng)PI3K/Akt通路介導(dǎo)了Ang-1誘導(dǎo)的血管再生［15］。

2.1.3 一氧化氮合酶(Nitric oxide synthases，NOS)NOS以3種亞型存在，其中2種(nNOS，eNOS)是長期存在的，還有1種(iNOS)是誘導(dǎo)生成的。nNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的組織內(nèi)產(chǎn)生NO。iNOS既存在免疫系統(tǒng)里，也存在于心血管系統(tǒng)。eNOS也被稱為NOS3，在血管內(nèi)產(chǎn)生NO，由此產(chǎn)生的NO在調(diào)節(jié)全身血壓、血管緊張性、血管重塑和血管再生方面起關(guān)鍵作用［16，17］。缺乏eNOS的鼠腦缺血區(qū)血管再生減少［18］。曾有實驗給予卒中后24h的大鼠NO生成物-DETANONOate，結(jié)果增大了血管半徑，增加了分化的大腦內(nèi)皮細胞的數(shù)量和缺血區(qū)新生血管的數(shù)量［19］。BK、VEGF與其受體結(jié)合后通過PI3-AKt信號通路刺激eNOS的磷酸化，從而使其活化并發(fā)揮重要作用［20］。BK與B2R結(jié)合可上調(diào)eNOS，介導(dǎo)血管再生效應(yīng)［21］。

2.1.4 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF) FGF家族是被發(fā)現(xiàn)的第一類可刺激血管內(nèi)皮細胞生長的生長因子［22］。它們的主要作用是刺激內(nèi)皮細胞的遷移、分化、出芽和血管形成。但是它的兩個成員-酸性成纖維細胞生長因子(FGF-1)和堿性成纖維生長因子(FGF-2)都缺乏其特有的分泌信號，它們在時空上的表達不總是與血管再生的活躍相關(guān)，且二者或其一的缺乏不能導(dǎo)致主要的血管缺陷［23，24］。Hara 等［25］分析了 FGF-1 在鼠大腦缺血區(qū)的表達特征，免疫染色后的FGF-1在正常動物大腦中不能被發(fā)現(xiàn)，而神經(jīng)元和巨噬細胞受到缺血性損害后24h可發(fā)現(xiàn)FGF-1的表達，在血管閉塞后14d達到高峰。FGF-2與FGF-1相反，在正常腦組織神經(jīng)元內(nèi)可發(fā)現(xiàn)FGF-2mRNA表達［26］，在腦梗死后1d可發(fā)現(xiàn)FGF-2水平增高［27］。Krupinski等通過分析人類腦梗死后的腦組織樣本發(fā)現(xiàn)缺血半暗帶的FGF-2表達增加［28］。BK與B1受體結(jié)合后誘導(dǎo)NOS的激活和cGMP的積聚，從而轉(zhuǎn)導(dǎo)FGF-2的上調(diào)和后毛細血管內(nèi)皮細胞的分化［29］。另外，VEGFR2拮抗劑可抑制FGF介導(dǎo)的血管再生，這表明FGF的促血管再生作用與VEGF相關(guān)［30］。

2.1.5 基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP) MMP家族的成員涉及細胞外基質(zhì)在生理和病理條件下的重塑。它們在細胞外基質(zhì)降解和內(nèi)皮細胞浸潤、遷移中起到重要作用，從而促進缺血區(qū)血管新生。VEGF可增加MMP的表達。在內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成時生成MMP-1、MMP-2和MMP-9［31］。Stone等人通過實驗證明TK的過度表達增加組織中MMP-9的激活，而缺乏MMP-9的肢端缺血鼠經(jīng)TK治療后效果不佳，說明TK促進神經(jīng)功能恢復(fù)及血管新生的作用是通過MMP來實現(xiàn)的［32］。

2.1.6 肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF) HGF是由間質(zhì)細胞源性的細胞分泌的一種不活躍的前體，它是通過尿激酶(uPA)或組織型纖溶酶原激活物(tPA)的蛋白水解分離作用被激活的［33，34］。HGF結(jié)合并激活酪氨酸蛋白激酶受體c-met(主要被發(fā)現(xiàn)在上皮細胞和內(nèi)皮細胞)，產(chǎn)生強大的促血管再生作用。其機制部分是由于HGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞上 VEGF 的生成［35，36］。此外，Sengupta 等通過實驗抑制VEGFR2，仍可發(fā)現(xiàn)HGF介導(dǎo)的持續(xù)的血管再生效應(yīng)。這說明HGF還可誘導(dǎo)與VEGF途徑無關(guān)的促血管再生作用［37］。Shimamura等［38］通過動物實驗表明，HGF 過度表達導(dǎo)致梗死面積明顯減小，此外HGF過度表達的大鼠大腦皮質(zhì)的毛細血管密度較對照組增高。HGF對凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)起負性調(diào)節(jié)作用［36］，而 TSP1 與包括促內(nèi)皮細胞凋亡在內(nèi)的抗血管再生途徑相關(guān)。TSP1的表達缺陷與血管生成作用減弱有關(guān)聯(lián)［39］。KKS可促進多種血管生長因子(VEGF，F(xiàn)GF等)的功能，從而間接誘導(dǎo)Ets-1的激活，Ets-1可促進HGF的生成和釋放，HGF也可促進Ets-1的激活，從而形成正反饋，促進內(nèi)皮細胞的活化［40］。

另外，KKS還可影響其他血管生成相關(guān)因子，如血小板源性生長因子(PDGF)、前列腺素(PG)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等，它們與相應(yīng)受體結(jié)合后作用于內(nèi)皮細胞，也可產(chǎn)生促血管新生的作用。

2.2 血管生成相關(guān)細胞 毫無疑問，內(nèi)皮細胞增殖和遷移是成人微血管新生過程的主要部分。但是骨髓源性的內(nèi)皮祖細胞(EPCs)的發(fā)現(xiàn)與血管生成僅發(fā)生在胚胎血管形成的過程中這一觀念相抵觸?，F(xiàn)已推斷出的EPCs的成員(被定義為CD133+，CD34+和VEGF受體Ⅱ激酶結(jié)構(gòu)域激活的細胞)大部分來源于骨髓;一些研究也表明，EPCs是從脾臟，肝臟，人臍帶血，骨髓源性單核細胞，CD34或CD133陽性的造血干細胞和人外周血單核細胞中培養(yǎng)出來的。EPCs在正常情況下循環(huán)于外周血中，清除損傷的內(nèi)皮細胞以進行血管修復(fù)。此外，EPCs可向損傷組織聚集，并通過分泌多種生長因子促進神經(jīng)細胞存活，神經(jīng)發(fā)生，刺激血管再生的途徑參與損傷修復(fù)或創(chuàng)傷治療。給予EPCs可促進血管生成，減小梗死面積，增加缺血部位的血流。血液循環(huán)中EPCs向血管新生部位聚集并分化為內(nèi)皮細胞，這一過程與“血管生成”相關(guān)，是胚胎血管新生的關(guān)鍵模式［41］。有人通過實驗證明骨髓源性EPCs參與腦缺血后腦血管新生［42］。許多促血管再生因子可影響外周血EPCs的數(shù)量［43］。激肽與B1、B2受體結(jié)合后上調(diào)VEGF的水平，VEGF通過與VEGFR2結(jié)合將生存和有絲分裂的信號傳遞給EPCs和造血干細胞，從而發(fā)揮血管新生的作用［44，45］。目前有研究將eNOS與血管新生過程聯(lián)系起來-獲得性血管生成，它與EPCs所介導(dǎo)的血管形成相關(guān)［46］。此外，將野生型祖細胞直接注入eNOS基因敲除可逆轉(zhuǎn)血管新生的缺陷，這表明eNOS介導(dǎo)的血管再生過程與EPCs有關(guān)［16］。

3 展望

隨著對KKS作用機制的認識逐漸拓展，KKS在臨床治療中的應(yīng)用也不斷增多，不僅可增強腦保護，還可促進缺血部位血管新生。目前治療的研究重點主要在基因治療方面，Xia等將攜帶TK基因的腺病毒注入MCAO大鼠腦室內(nèi)，可減輕神經(jīng)功能缺失，縮小梗死面積［3］。雖然越來越多的證據(jù)證明KKS在缺血性卒中的治療方面的成效，但仍有一些問題尚待解決。今后，在臨床治療缺血性疾病時應(yīng)用KKS中的有效成分，不僅局限于其舒張血管及神經(jīng)保護的作用，還著重利用其促血管再生的作用，這為我們積極、有效、全面的治療缺血性卒中開辟了嶄新的思維。而有關(guān)此機制的基因治療仍僅限于動物實驗階段，未來在臨床實施方面仍需進一步努力。

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