甜菜黃化病毒病的研究進展

王 麗，鄭 毅，卞桂杰

（吉林省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟植物研究所，公主嶺136105）

甜菜黃化病毒病在美國 （1951）最先流行[1]，屬于井上忠男等 （1973）[2]記載的甜菜黃化病毒屬（closterovius）。該病毒由蚜蟲介導進行半持久性傳播，目前分布于世界大部分甜菜產(chǎn)區(qū)，包括歐洲、南北美洲、亞洲及澳洲。在我國的東北、內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、新疆、河北、山西、陜西等地均有大范圍發(fā)生，并有進一步蔓延的趨勢。有研究表明甜菜黃化病毒病一般年份的發(fā)病率50%～60%，塊根減產(chǎn)20%～25%，含糖率下降2%～3%，染病種子減產(chǎn)30%，已經(jīng)成為影響全世界甜菜生產(chǎn)的主要限制因素之一[3－7]。

1 甜菜黃化病毒病癥狀

經(jīng)調(diào)查，根據(jù)甜菜黃化病毒病在甜菜上的癥狀表現(xiàn)可分為花葉型、黃化型、壞死黃脈型（具叢根癥狀）和黑色焦枯型4大類型，其中花葉型又分為黃色泡斑花葉、系統(tǒng)環(huán)斑花葉和黃脈皺縮花葉3個類型。

因為甜菜黃化毒病是系統(tǒng)性病害，田間植株染病后往往下層靠近底部的葉片首先表現(xiàn)出癥狀?？拷~尖、葉緣部分出現(xiàn)清晰的明脈，隨著葉脈間組織失綠，邊緣出現(xiàn)不明顯的漩渦狀鮮黃色斑，黃斑隨后擴大連成片，向葉底部發(fā)展，除葉脈外其余部分變成具金屬光澤的黃色，有時呈現(xiàn)類似大理石狀斑紋，一天后全葉變成黃色，葉片變黃并增厚、僵硬，質(zhì)地變脆，易折斷。病葉膨壓增加，蒸騰作用減少，在干旱條件下仍不發(fā)生萎蔫，盛夏中午田間健全葉萎蔫下垂時病葉仍向上直立，嚴重病葉主脈上可見有維管束壞死變黑狀。病葉全變黃。漸轉(zhuǎn)變?yōu)轺龅?，形成無數(shù)黑褐色枯斑，病斑近“回”形或不規(guī)則狀，有時有輪紋，病葉最后枯萎卷曲而死。采種株癥狀與一年生甜菜相同。

2 甜菜黃化病毒病的寄主植物、傳播途徑和流行原因

2.1 寄主植物

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)15科121種植物受其感染，可系統(tǒng)侵染甜菜、菠菜、亮色藜、西風古、歐千里光和番杏，局部侵染墻生藜等。保存和繁殖該病毒的最好寄主是番杏和甜菜[8]。

2.2 傳播途徑

黃化病毒主要在采種母根和藜科、莧科雜草上越冬，成為初次侵染來源。一般先在采種母株上發(fā)病，再由至少22種蚜蟲以半持久性傳播到原料甜菜地里，包括豌豆蚜、蠶豆蚜、棉蚜、甘蔗蚜、馬鈴薯長管蚜等[8]。在田間的兩個主要介體是桃蚜和豆蚜。病毒不能傳播到子代蚜蟲，蚜蟲蛻皮后不帶毒。病毒不能經(jīng)過種子傳播，可以機械傳播，但是極為困難。

2.3 甜菜黃化病毒病流行原因

甜菜黃化病毒病的流行發(fā)生受綜合因素的影響，年度間發(fā)病輕重不同的主要原因是品種抗性，田間發(fā)病輕重不同的主要原因是栽培管理技術(shù)。肥、水量供應(yīng)、密植程度和發(fā)病亦有關(guān)系。缺磷鉀肥的甜菜，發(fā)病較嚴重，而多施用綠肥和廄肥的甜菜，發(fā)病則較輕。冬季寒冷的國家，病毒的介體蚜蟲不能在戶外過冬，發(fā)病率低。

3 甜菜黃化毒病的致病機理

3.1 黃化病毒種類

甜菜黃化病毒病的病原有兩種，壞死型黃化病毒和溫和型黃化病毒，其傳播方式，引起癥狀有所不同，通常兩種病毒混合侵染。

壞死型黃化病毒又叫甜菜黃化病毒（beet yellows virus，BYV），它使葉片發(fā)生檸檬黃色，繼而出現(xiàn)帶紅色病斑，并蔓延聚成片，為半宿存式傳播。

溫和型或微弱型黃化病毒（beet mild yellowing virus，BMYV）僅進行宿存式傳播，病原通常從葉尖侵入，發(fā)生枯黃色變，易導致黑斑病菌（交鏈孢菌）的二次侵染。另外BMYV的變種BWYV（beet western yellows virus）又稱甜菜西方黃化病毒，美國與日本發(fā)生的是BWYV，新疆為BYV和BWYV。

3.2 黃化病毒病原

黃化病毒是具有特別長絲狀的病毒粒子，這些病毒顆粒主要成分是由衣殼蛋白和一條單一的正義RNA組成。內(nèi)含一個編碼的熱休克蛋白HSP70的基因，參與病毒的繁殖、病毒RNA運輸?shù)冗^程。絲狀體直徑10～12 nm，長1.25μm。病毒體外存活期2～3d。52℃經(jīng)10 min致死。稀釋限點 1萬倍[9－10]。病毒在甜菜葉部、葉柄、莖、篩管的柔膜細胞的細胞質(zhì)中寄生，根細胞也有。病毒侵染后破壞細胞原有生理活動，破壞葉綠體，葉綠素含量急劇下降，光合作用受阻。病毒在葉脈團聚，葉脈、葉柄輸導組織維管束被堵塞、破壞，造成淀粉積累，利于交鏈孢菌等腐生菌的侵染，維管束壞死變黑，葉部光合產(chǎn)物不能輸送到根部，使塊根產(chǎn)量和含糖量增長受到抑制。

4 病毒檢測方法

4.1 昆蟲介體接種法

由于BYV不能通過人工摩擦接種和機械傳毒，因此，需利用蚜蟲進行接種，然后調(diào)查植株的癥狀以鑒定BYV。此方法是常用的鑒定方法，操作比較簡便。但其特異性較差，往往存在一病多癥、多病一癥的現(xiàn)象；而且易受季節(jié)限制，檢測周期長（1～2個月），易受到生長條件、氣候、土壤等外界環(huán)境的影響。因而應(yīng)用該技術(shù)檢測病毒靈敏性較差，難以區(qū)分病毒種類。

4.2 電鏡法

利用病毒特異性抗體誘捕或包被病毒粒體，產(chǎn)生免疫吸附反應(yīng)，采用電鏡法從病株上檢出BYV粒體，即利用已知的病毒抗體對感病的樣本進行檢測，觀察抗體抗原反應(yīng)來鑒定BYV的分離物，但多數(shù)情況下檢出數(shù)量少，有時還不能確切斷定有無感染。因而，有研究改用免疫電鏡法（SSEM），可有效地檢測純化的BYV分離物，但最佳抗原稀釋度很難掌握。仍有很多雜質(zhì)附著在膜上，對粗提物的檢測不是很準確。因此，這種條件對BYV檢出不太適合。

4.3 血清學檢測技術(shù)

植物病毒衣殼蛋白（CP）具有抗原性，很多病毒可以被提純并制成高效價的抗血清。根據(jù)特異性的抗體抗原免疫學反應(yīng)可檢測植物病毒的存在。血清學方法的發(fā)展推動了植物病毒檢測技術(shù)的發(fā)展。甜菜、蕪菁、大麥、茄子黃化病毒均采用此法。通過單克隆抗體，采用異種動物雙抗夾心法[11]或間接三層夾心法[12]來達到檢測BYV的目的。此外酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)對不同黃化病毒的鑒定已在相當多的禾本作物和雜草中有了應(yīng)用。但是ELISA檢測中，血清學存在假陽性結(jié)果。

4.4 PCR、RT-PCR和標記探針技術(shù)

PCR和RT-PCR是一種檢測RNA病毒行之有效的方法。近年來在病毒檢測領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用?？梢詸z測植株中黃化病毒并快速鑒別出BYV和BWYV。PCR和RT-PCR分子檢測技術(shù)以其靈敏性高，無放射性等優(yōu)點，正廣泛應(yīng)用于甜菜植株和介體蚜蟲體內(nèi)的BYV的病毒檢測。

根據(jù)互補的核酸單鏈可以相互結(jié)合的原理，將標記探針與互補的待測病毒核酸雜交，帶探針的雜交物指示病原物的存在。近年來應(yīng)用非放射性探針分子，如生物素或地高辛標記的探針分子更安全，應(yīng)用限制少，壽命更長，與放射性標記的探針一樣靈敏實用。此方法靈敏度高，可以對低濃度的BYV進行檢測。

5 抗黃化病毒病育種

5.1 甜菜黃化病毒的抗源

BMYV的抗源在野生和栽培甜菜中均可獲得，但是，雖然有耐病品種等可供選用，因其抗性為隱性，易受環(huán)境影響。截至目前，育種工作者仍未找到BMYV抗源。通過遺傳工程得到的純化BMYV甜菜抗源材料并得以實際應(yīng)用的研究也尚未見報道

選育抗病品種是防治BMYV最為經(jīng)濟環(huán)保有效的方法。傳統(tǒng)的抗黃化病毒甜菜育種是以回交、自交等方法選育出的兼抗兩種或兩種以上的病毒病甜菜品種。目前，國內(nèi)外還未發(fā)現(xiàn)抗病品種，已經(jīng)篩選出了較抗病的品種工農(nóng)2號、內(nèi)蒙古3號、甜研3號等和耐病性的品種如新甜系列、蘇墾系列和德國KWS5007、5075等。東部甜菜栽培區(qū)推廣的優(yōu)良品種有甜研304、甜研309，荷蘭RIMA和德國KWS0149主要用于紙筒育苗移栽。大田選用的KWS、RIMA是世界公認的遺傳耐病種質(zhì)。從大面積觀察來看，國產(chǎn)品種抗病力優(yōu)于國外品種；國內(nèi)和國外合作育出的品種又優(yōu)于國外品種。

5.2 基因工程技術(shù)在抗甜菜黃化病毒病育種上的應(yīng)用

Pink等[13]在萵苣品種Burs17和Crysta L heart上發(fā)現(xiàn)了抗BYV基因。Casper等[14]已從BWYV克隆cDNA和CP序列，構(gòu)建了基因。英國劍橋研究人員發(fā)現(xiàn)了抗蚜蟲基因和野生種中抗黃化病毒基因，可用來阻止黃化病毒的轉(zhuǎn)移和傳播，將用于育種研究抗CMV分子育種。甜菜黃化病毒是一種線狀病毒，其病毒組的最突出特點之一是它們都含有一個編碼的熱休克蛋白HSP70的基因。因此識別與HSP70相結(jié)合的其他蛋白質(zhì)對研究甜菜黃化病毒具有重要意義。金紅等利用酵母雙雜合體系統(tǒng)，表達質(zhì)粒檢測了甜菜黃化病毒蛋白質(zhì)間相互作用[15]。葉克窮和Dinshaw J.Patel編碼了甜菜黃化病毒的抑制基因p19和p21，阻止直接結(jié)合的siRNA，在這個過程中關(guān)鍵的調(diào)解使黃化病毒基因沉默[16]。為分子水平上提出病毒防治機制提供一定的理論基礎(chǔ)。

6 小結(jié)與討論

本文對BYV的發(fā)病癥狀和致病機理、甜菜黃化病毒病檢測的方法、危害情況和抗病育種等最新研究進展進行了綜述。對于有效防治BYV的發(fā)生具有重要意義。在理論上，甜菜黃化是由病毒造成的。在生產(chǎn)實際上，造成甜菜黃化的原因存在爭議。有部分研究人員認為是生理現(xiàn)象，也有部分研究人員則認為是由病毒所引起的。因此，不論是在理論方面，還是在生產(chǎn)方面，該問題都急待解決[17-18]。利用分子生物學方法進行抗黃化病毒育種在煙草、番茄上運用較多[19-20]，一些抗黃化病毒疫苗也已經(jīng)投入市場。國內(nèi)在甜菜上的運用鮮有報道。但是相關(guān)研究報道對甜菜的抗病分子育種提供了理論基礎(chǔ)，越來越豐富的抗性材料對于缺乏抗源的BMYV抗性育種是未來研究的關(guān)鍵。

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