間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)特性

包新杰 王任直

Friendenstein等[1]最先發(fā)現(xiàn)，骨髓中貼壁生長的單核細(xì)胞在一定條件下可向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。隨后，研究人員又相繼在脂肪、肌肉等組織中分離出類似細(xì)胞，并將其統(tǒng)一命名為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。近年來，MSCs作為組織工程良好的種子細(xì)胞被運(yùn)用于一系列基礎(chǔ)和臨床研究中[2]。另外，很多研究顯示，除免疫原性低外，MSCs還具備免疫抑制等特性[3-4]。雖然具體機(jī)制尚不十分清楚，也存在一些爭議，但MSCs在移植和自身免疫性疾病等領(lǐng)域的潛在利用價(jià)值已成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)[5]。

一、MSCs的免疫原性

體外實(shí)驗(yàn)表明，MSCs的免疫原性很低，這可能與 MSCs 低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物( major histocompatibility complex,MHC )I、但不表達(dá) MHC II 和一些重要的免疫協(xié)同刺激分子如CD40、CD80和CD86等有關(guān)[6]。將MSCs與異種或同種異體 T 細(xì)胞共培養(yǎng)，并不引起T細(xì)胞的顯著增殖[7]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，Li等[8]通過靜脈途徑應(yīng)用同種異體 MSCs 治療大鼠缺血性腦卒中，也并未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)。因而有學(xué)者提出，在運(yùn)用非自體 MSCs 進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)或治療時(shí)無需使用免疫抑制劑，但很多人卻拿出了一系列證實(shí)發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[9-10]。Nauta 等[9]將同種異體 MSCs 靜脈注入小鼠體內(nèi)后，記憶T細(xì)胞顯著增多，排斥反應(yīng)明顯。另有研究發(fā)現(xiàn)，異體MSCs在體外雖無免疫反應(yīng)性，但移植到體內(nèi)后卻發(fā)生了免疫排斥反應(yīng)[10]。最近，Sadek 等[11]發(fā)表評論認(rèn)為，現(xiàn)在并沒有足夠的證據(jù)證明非自體 MSCs 體內(nèi)移植不會引發(fā)免疫反應(yīng)，所以適當(dāng)使用免疫抑制劑是必要的?？梢?，MSCs 的免疫原性問題(尤其在體內(nèi))已成為目前爭論的焦點(diǎn)。

二、MSCs的免疫抑制作用

Yanez等[12]在給小鼠靜脈移植同種異體造血干細(xì)胞( hematopoietic stem cell,HSC )的同時(shí)靜脈輸入供體脂肪來源的MSCs發(fā)現(xiàn)，移植物抗宿主反應(yīng)( graft versus host disease,GVHD )明顯減輕。一項(xiàng)多中心臨床試驗(yàn)中，46例血液病患者在輸注匹配的HSC之前4h，提前輸入骨髓來源的MSCs，術(shù)后GVHD的發(fā)生率明顯降低，發(fā)病程度亦顯著減輕[13]。在Bartholomew等[14]對狒狒進(jìn)行的異體皮膚移植實(shí)驗(yàn)中，靜脈輸入供體骨髓來源的MSCs，可以使皮瓣存活時(shí)間延長，并認(rèn)為其免疫抑制作用與環(huán)孢菌素等免疫抑制劑相當(dāng)。目前認(rèn)為，MSCs的免疫抑制作用與免疫系統(tǒng)的多種效應(yīng)細(xì)胞有關(guān)。

( 一 )MSCs 與 T 細(xì)胞

將MSCs 加入由同種異體刺激引起的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)( mixed lymphocyte response,MLR )體系中，T細(xì)胞的增殖反應(yīng)會被顯著抑制，這種抑制效應(yīng)與MSCs的來源無關(guān)，可以是刺激源或是反應(yīng)源的，也可以來源于無關(guān)的第三方[15-16]。MSCs還可抑制由非特異性絲裂原(刀豆蛋白、植物血凝素)[17]、CD3和CD28抗體[16]，甚至異種[18]刺激引起的T細(xì)胞增殖反應(yīng)。MSCs的抑制作用是可逆的，去除MSCs后的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系可以再次被各種刺激物激活[18]。

MSCs 抑制 T 細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚未完全清楚。Krampera 等[16]認(rèn)為與細(xì)胞間的直接接觸有關(guān)，用半透膜將MSCs 與 MLR 體系物理性分隔，與分隔前相比，T 細(xì)胞增殖被抑制的程度顯著下降。但 Di Nicola 等[17]發(fā)現(xiàn)，MSCs 在被半透膜分隔后仍能有效地抑制 T 細(xì)胞增生。但在 MSCs 與 MLR 的共存體系中加入轉(zhuǎn)化生長因子( transforming growth factor-β,TGF-β )和肝細(xì)胞生長因子( hepatocyte growth factor,HGF )的抗體后，MSCs對 T 細(xì)胞增殖的抑制作用則明顯減弱，因此推測起作用的是MSCs分泌的一些可溶性因子，如 TGF-β和HGF等，而直接接觸并非必需。最近，Sato等[19]發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的一氧化氮(NO)對T細(xì)胞增殖的抑制作用更為重要。除此之外，有人發(fā)現(xiàn)，IFN-γ誘導(dǎo)下的 MSCs 可以表達(dá)一種酶，稱為吲哚胺-2,3-二氧化酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)，該酶可將色氨酸酶解為犬尿氨酸，從而抑制 T 細(xì)胞的增殖[20]，但其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

（二）MSCs與樹突狀細(xì)胞

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)是一類重要的抗原呈遞細(xì)胞，在T細(xì)胞的增殖中起著重要作用。研究表明，MSCs會干擾DC的分化與成熟，導(dǎo)致DC功能受損，從而影響T細(xì)胞的增殖，在MSCs干預(yù)下形成的DC表面不表達(dá)CD83；另外，DC分泌的許多因子會發(fā)生變化，如炎癥前因子TNF-α、IFN-γ和IL-12下調(diào)，而抗炎因子IL-10卻上調(diào)[21]。

用半透膜將MSCs和DC分隔后的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs對DC的抑制主要是由MSCs分泌的一些可溶性因子介導(dǎo)的，如IL-6、M-CSF和PGE2[22]。而DC在MSCs干擾下表達(dá)上調(diào)的IL-10亦可強(qiáng)化MSCs的抑制作用，當(dāng)用抗體中和IL-10后，T細(xì)胞的增殖可部分恢復(fù)[23]。

（三） MSCs與自然殺傷細(xì)胞

自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞主要對表面缺乏MHC I表達(dá)的細(xì)胞有溶解作用。研究表明，MSCs能夠抑制IL-2或IL-15誘導(dǎo)的NK細(xì)胞的增殖以及IFN-γ的產(chǎn)生[24-25]；MSCs并不能抑制新分離的NK細(xì)胞的溶解能力[24]，但共培養(yǎng)4～5d后MSCs對IL-2誘導(dǎo)的NK細(xì)胞的溶解作用產(chǎn)生顯著抑制[26]。Sotiropoulou等[25]發(fā)現(xiàn)，DC細(xì)胞短期與MSCs共培養(yǎng)后，其溶解表面MHC I陽性腫瘤細(xì)胞的能力受到抑制，但并不影響對表面MHC I陰性細(xì)胞的溶解。

MSCs抑制DC細(xì)胞的機(jī)制較為復(fù)雜?？扇苄砸蜃覲GE2和TGF-β被認(rèn)為是最重要的，但細(xì)胞間的直接接觸亦發(fā)揮一定作用[25]。最近，Spaggiari等[27]研究發(fā)現(xiàn)，IDO的作用亦相當(dāng)關(guān)鍵，其可以下調(diào)NK細(xì)胞表面激動受體的表達(dá)，如NKp30、NKp44和NKG2D，從而抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌和細(xì)胞毒性。

長期以來，MSCs被認(rèn)為具有免疫豁免的特性，不被新分離的NK細(xì)胞所溶解[24]。但最近有研究顯示，激活的NK細(xì)胞能有效溶解非自體來源的MSCs[28]。盡管MSCs表面表達(dá)MHC I，從而躲避NK細(xì)胞，但激活的NK細(xì)胞能識別MSCs表面的其他配體，最終溶解MSCs[28]。當(dāng)用IFN-γ誘導(dǎo)MSCs后，細(xì)胞表面MHC I表達(dá)升高，NK細(xì)胞介導(dǎo)對MSCs溶解作用下降[28]。

（四）MSCs與 B 細(xì)胞

MSCs能抑制由IL-4[29]或有絲分裂原[30]誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖。在對系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型BXSB小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，同種異體MSCs除抑制B細(xì)胞增殖外，還可以抑制B細(xì)胞的活化以及IgG抗體的分泌[31]。這與用人MSCs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的[32]。Krampera等[26]的研究顯示，在IFN-γ環(huán)境下，MSCs僅抑制B細(xì)胞的增殖，這可能與IFN-γ刺激MSCs產(chǎn)生IDO有關(guān)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，MSCs分泌的可溶性因子在MSCs抑制B細(xì)胞的過程中起主要作用[32]。

三、研究結(jié)果之間存在差異的原因

目前，盡管已經(jīng)對MSCs的免疫原性、免疫抑制作用及其相關(guān)的作用機(jī)理做了大量的研究，但是不同實(shí)驗(yàn)室所得到的研究結(jié)果之間有一致的地方，也有不一致的方面，甚至有些結(jié)果截然相反。這可能與不同實(shí)驗(yàn)室之間實(shí)驗(yàn)條件存在差異等很多因素有關(guān)，但MSCs的異質(zhì)性問題顯然不容忽視。

因?yàn)镸SCs表面缺乏特異標(biāo)志物，最終分離得到的MSCs是一個(gè)異質(zhì)的細(xì)胞群，缺乏均一性[2,33]。對此，國際細(xì)胞治療協(xié)會于2006年提出3個(gè)最低標(biāo)準(zhǔn)[34]：(1)必須是貼壁的細(xì)胞；(2)表面CD105、CD73和CD90陽性，而CD45、CD34、CD14和CD11b必須為陰性；(3)在體外必須具備向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。以上標(biāo)準(zhǔn)對MSCs的統(tǒng)一起到積極作用，但是研究發(fā)現(xiàn)滿足以上條件的MSCs仍然無法達(dá)到均一化的要求，提示需要參考更多的表面標(biāo)志。

另外，不同實(shí)驗(yàn)室采用的培養(yǎng)和分離方法不盡相同，導(dǎo)致最終各自使用的MSCs存在差異，這勢必會造成不同研究的結(jié)果之間產(chǎn)生分歧，影響相互間的比較。如何純化和統(tǒng)一MSCs至今是個(gè)難題，有待進(jìn)一步研究。

四、安全問題

盡管已有一些臨床研究對移植MSCs后的患者進(jìn)行了長期的觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用，但是MSCs移植入體內(nèi)后的安全性問題至今仍是爭論的焦點(diǎn)，如異位組織生成和細(xì)胞惡變成瘤等，其本質(zhì)是對MSCs的最后轉(zhuǎn)歸缺乏認(rèn)識。

另外，隨著對MSCs免疫學(xué)特性研究的深入，學(xué)者們勢必會考慮MSCs對宿主免疫系統(tǒng)抑制后帶來的感染問題，包括細(xì)菌、病毒和真菌感染。有人認(rèn)為，因MSCs具有向損傷部位聚集的特性，故推測MSCs的免疫抑制作用有可能是區(qū)域性的。但最近一項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)顯示，無論是局部還是全身移植MSCs均會對宿主的整個(gè)抗腫瘤免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，有助于植入宿主體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞形成腫瘤[18]。

五、展望

如上所述，雖然MSCs具備的低免疫原性和免疫抑制特性，為治療器官移植后的免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病帶來了希望，提供了一種新的治療手段。但是，我們尚未對MSCs完全認(rèn)識，仍然存在很多問題有待解決：如何進(jìn)一步純化MSCs？MSCs的免疫原性究竟如何？體內(nèi)移植非自體MSCs時(shí)，是否有必要使用免疫抑制劑？MSCs發(fā)揮免疫抑制作用的確切機(jī)制是什么？移植非自體MSCs是否會誘發(fā)感染和腫瘤形成等。相信隨著研究的不斷深入，我們對MSCs的理解和應(yīng)用會更加深刻和合理。

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