變形鏈球菌LuxS蛋白與LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究進(jìn)展

夏 麗 儲(chǔ)冰峰

變形鏈球菌是口腔致齲的主要細(xì)菌之一。變形鏈球菌能夠選擇性地在牙齒表面黏附，形成細(xì)菌生物膜，促進(jìn)菌斑形成，通過攝入蔗糖、葡萄糖和果糖等進(jìn)行糖酵解，產(chǎn)生能量同時(shí)生成大量乳酸，使牙齒硬組織脫鈣致齲。LuxS蛋白酶在1999年被Winzer等人[1]證實(shí)存在，但早在上世紀(jì)60年代該蛋白酶就作為S-核苷高半胱氨酸(S-ribosylhom ocysteine,SRH)的裂解酶被報(bào)道[2]，是細(xì)菌轉(zhuǎn)甲基作用和蛋氨酸循環(huán)合成途徑之一的關(guān)鍵酶。近年來，有大量的研究報(bào)道了，LuxS作為自體誘導(dǎo)信號(hào)分子-2(autoinducer-2,AI-2)生物合成中不可或缺的酶。

口腔環(huán)境中存在大量細(xì)菌，細(xì)菌能夠適應(yīng)環(huán)境的變化是通過識(shí)別細(xì)胞外的信號(hào)，調(diào)控自身基因表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。這種胞外信號(hào)由細(xì)菌產(chǎn)生后，可以調(diào)控同種細(xì)菌數(shù)量，也可以被異種細(xì)菌識(shí)別，作為異種細(xì)菌間的交流信號(hào)，調(diào)節(jié)不同種屬細(xì)菌的生物行為，這一現(xiàn)象被稱為群體感應(yīng)[3](quorum sensing,QS)。已在多種革蘭氏陰性和陽性菌中證實(shí)并且在大量研究中發(fā)現(xiàn)AI-2可以介導(dǎo)不同種屬間的細(xì)菌交流。在各種不同細(xì)菌中，LuxS的同系物參與AI-2的生物合成。AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)機(jī)制可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，包括生物膜形成、毒力因子、生物熒光、抗生素耐藥性、形成孢子和形成感受態(tài)等。干擾這一系統(tǒng)會(huì)改變細(xì)菌的致病性，由于LuxS/AI-2在不同的細(xì)菌中調(diào)節(jié)這些行為，也使其成為藥物抑制劑靶點(diǎn)。本文對(duì)變形鏈球菌中LuxS蛋白基因、結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制和功能，尤其是LuxS/AI-2群體感應(yīng)的相關(guān)內(nèi)容作一綜述。

1.LuxS蛋白的基因特點(diǎn)

變形鏈球菌的LuxS是含160個(gè)氨基酸的金屬蛋白酶，LuxS在細(xì)菌中有近50%的保守序列[4][5][6]。Wen等[7]通過對(duì)變形鏈球菌UA159全基因組的研究，發(fā)現(xiàn)與哈維氏弧菌同源的luxS基因。該基因位于染色體的nt443111到442632，由480個(gè)堿基對(duì)組成的開放閱讀框編碼。Merritt等[8]通過對(duì)變形鏈球菌基因進(jìn)行BLAST研究，發(fā)現(xiàn)LuxS蛋白基因編碼的氨基酸序列在革蘭氏陽性菌有高度同源性，與化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、乳酸球菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌的LuxS蛋白分別有84%、83%、64%、45%的一致性和92%、91%、79%、64%的相似性；在革蘭氏陰性菌也有顯著的同源性，與哈維氏弧菌、腦膜炎奈瑟氏菌、大腸桿菌、流感嗜血桿菌的LuxS蛋白分別有38%、36%、37%、37%的一致性和57%、58%、59%、58%的相似性。說明LuxS蛋白的保守性較好，可能與其發(fā)揮重要的生理功能有關(guān)。

2.LuxS蛋白的結(jié)構(gòu)

LuxS蛋白有HXXEH(His-Xaa-Xaa-Glu-His)保守序列，這種序列通常在含有Zn2+的蛋白中測得。LuxS的晶體結(jié)構(gòu)既有游離的基團(tuán)，又存在S-核苷高半胱氨酸(S-ribosylhomocysteine,SRH)或高半胱氨酸，溶解度高[9]。LuxS存在同型二聚體，每個(gè)亞基的殘基在二聚體表面有相同的活化位點(diǎn)，每個(gè)活化位點(diǎn)存在一個(gè)二價(jià)的金屬離子，以前被認(rèn)為是Zn2+，近年來Pei等[10]認(rèn)為是Fe2+。在枯草桿菌中金屬離子的4面分別與HXXEH保守序列的54位和58位組氨酸、126位半胱氨酸和水分子結(jié)合，這一結(jié)構(gòu)為酶的催化中心。Fe2+活化氧分子，半胱氨酸被氧化為磺丙氨酸，蛋白結(jié)構(gòu)改變，LuxS酶失活。LuxS金屬蛋白酶的配基環(huán)境與多肽的去甲?；赶嗨疲現(xiàn)e2+形式的LuxS在有氧的環(huán)境下會(huì)迅速失活，而由Zn2+或Co2+組成的LuxS蛋白形式卻非常穩(wěn)定，Co-LuxS的催化能力與Fe-LuxS相同，比Zn-LuxS強(qiáng)10倍。

3.LuxS的作用機(jī)制

LuxS催化非氧化還原反應(yīng)的硫醚鍵斷裂[11]。Pei等[10]認(rèn)為LuxS催化的反應(yīng)是一種金屬催化羰鍵轉(zhuǎn)移的反應(yīng)。在水溶液中，SRH的核糖環(huán)水合后以醛的形式處于平衡狀態(tài)，形成酶-底物復(fù)合體。SRH的C1羰鍵打開與酶的金屬離子結(jié)合，取代酶中金屬離子結(jié)合的水分子或氧。隨著金屬離子的增多，SRH的C2堿基與酶的其他活化位點(diǎn)結(jié)合，形成五碳烯二醇化物，溶液中質(zhì)子增加，與酶結(jié)合的C1羰鍵的氧再結(jié)合質(zhì)子，形成含酮鍵的互變異構(gòu)體中間產(chǎn)物，C2形成羰基，與酶的金屬離子結(jié)合，C1羰鍵與酶斷開。如此循環(huán)，最后進(jìn)行β-消除，產(chǎn)生4，5-二羥基-2，3-戊二酮(4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione， DPD)，DPD再自發(fā)轉(zhuǎn)化成酮式。

3.1 參與活化甲基代謝 LuxS在細(xì)胞甲基代謝中有重要作用，為細(xì)胞的RNA、DNA、特殊的代謝和蛋白提供甲基，是中間產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(S adenosylhomocysteine,SAH)循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。LuxS活化甲基代謝的反應(yīng)，有與催化形成AI-2相同的途徑，從S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)生成高半胱氨酸；也可由另一條途徑，經(jīng)SAH水解酶，直接將SAH催化生成高半胱氨酸，這一途徑不產(chǎn)生AI-2。高半胱氨酸在鈷胺素依賴的甲硫氨酸合成酶作用下生成甲硫氨酸，甲硫氨酸經(jīng)SAM合成酶催化形成SAM，完成轉(zhuǎn)甲基作用和蛋氨酸循環(huán)。

3.2 催化形成AI-2 AI-2由SAM經(jīng)過至少3步酶促反應(yīng)生成，SAM在甲基轉(zhuǎn)運(yùn)酶催化下與甲基供體反應(yīng)，生成毒性中間產(chǎn)物SAH，SAH與SAM結(jié)構(gòu)相似，是一個(gè)潛在的SAM依賴的甲基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制劑，SAH很快被S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase，Pfs)分解，生成腺嘌呤和 SRH，SRH由LuxS催化部分核糖基斷裂，形成烯醇形式的DPD和高半胱氨酸[12]，DPD自動(dòng)重排形成AI-2。研究[13]證實(shí)通過等位基因替換技術(shù)構(gòu)建的變形鏈球菌luxS缺陷株不能產(chǎn)生活性AI-2。

4.變形鏈球菌的LuxS和LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用

由于LuxS蛋白在細(xì)菌甲基代謝和AI-2合成中發(fā)揮重要作用，Merritt等[8]利用AI-2特異性報(bào)告菌株V.harveyi BB170證實(shí)，變形鏈球菌可產(chǎn)生功能性的AI-2，且在對(duì)數(shù)生長的中晚期達(dá)到最高值。已有研究證實(shí)LuxS與變形鏈球菌的生物膜形成、糖代謝、產(chǎn)酸耐酸、變鏈素等毒力因子密切相關(guān)。

luxS缺失突變的變形鏈球菌菌株的生物膜形成能力與培養(yǎng)條件相關(guān)。Wen等[7]建立luxS變異的變形鏈球菌UA159，在96孔板上培養(yǎng)，對(duì)生物膜形成沒有影響。Merritt等[8]則觀察到luxS缺陷株形成的生物膜結(jié)構(gòu)改變，表面粗糙，更易凝結(jié)成塊，對(duì)清潔劑和抗生素耐藥性增強(qiáng)。生物膜形成的變化與培養(yǎng)細(xì)菌的環(huán)境有關(guān)。在蔗糖介質(zhì)中變化明顯，luxS變異菌株生物膜松散呈巢穴狀，而野生株光滑平展。Yoshida等[14]建立luxS變異的變形鏈球菌GS-5，在0.5%蔗糖溶液中，變異株與野生株相比，生物膜明顯變稀薄，電子顯微鏡掃描顯示細(xì)菌凝聚團(tuán)塊變大。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AI-2調(diào)節(jié)了葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)而調(diào)控蔗糖依賴的生物膜形成。也有學(xué)者[15]用含蔗糖和葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)luxS缺失的變形鏈球菌UA159，觀察到在含蔗糖的培養(yǎng)基中l(wèi)uxS缺失菌株生物膜形成能力明顯減弱，證實(shí)LuxS/AI-2主要對(duì)蔗糖依賴的生物膜形成起調(diào)控作用。

LuxS和LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)也參與了變形鏈球菌糖代謝、產(chǎn)酸耐酸及一些應(yīng)激反應(yīng)的基因調(diào)控。Yoshida等[14]建立luxS變異的變形鏈球菌，在0.5%蔗糖溶液中，變異株在對(duì)數(shù)生長中期，葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的gtfB和gtfC基因表達(dá)上調(diào)，而gtfD基因略下調(diào)。Wen等[16]通過luxS缺陷株發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的毒力因子果聚糖酶下調(diào)了50%以上，菌株對(duì)酸更加敏感，但仍有一定的耐受性。Northern雜交顯示與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的RecA，SmnA(AP核酸內(nèi)切酶)，和Nth(核酸內(nèi)切酶)都下調(diào)，尤其在對(duì)數(shù)生長的早期，其他下調(diào)的基因還包括編碼膜相關(guān)蛋白的基因，如ffh(一個(gè)信號(hào)識(shí)別分子的亞單位)和brpA(生物膜調(diào)節(jié)蛋白A)，但對(duì)過氧化氫的耐受力增強(qiáng)。luxS基因缺失后，影響糖代謝和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因，luxS可能對(duì)細(xì)菌在酸性環(huán)境等一些應(yīng)激環(huán)境下的耐受性有一定調(diào)節(jié)作用。

變鏈素是變形鏈球菌合成分泌的抗菌性多肽，在牙菌斑菌落中抑制其他細(xì)菌使變形鏈球菌生存，根據(jù)其產(chǎn)生菌株的不同分為變鏈素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。在細(xì)菌密度高時(shí)，變鏈素Ⅰ的表達(dá)水平升高。研究表明[17][18]，luxS基因缺失導(dǎo)致變鏈素Ⅰ特異性結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)子mutA和轉(zhuǎn)錄激活子mutR轉(zhuǎn)錄水平降低。此外，變形鏈球菌luxS突變株中irvA(變鏈素I抑制子)的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，同時(shí)缺失luxS和irvA基因，變鏈素合成水平恢復(fù)。說明當(dāng)LuxS蛋白功能正常時(shí)irvA轉(zhuǎn)錄受到抑制，當(dāng)luxS基因缺失時(shí)irvA基因表達(dá)量大幅提高。高水平的irvA抑制mutA和mutR轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步導(dǎo)致變鏈素I合成水平降低。正常情況下，隨著細(xì)菌密度增加，變形鏈球菌分泌的AI-2達(dá)到一定濃度時(shí)，irvA的轉(zhuǎn)錄受到抑制，變鏈素I表達(dá)升高；當(dāng)luxS缺失時(shí)，irvA的表達(dá)增加，mutA和mutR轉(zhuǎn)錄受到抑制，變鏈素I表達(dá)降低。但luxS、irvA、mutR、mutA和變鏈素I具體的相互作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

LuxS和LuxS/AI-2系統(tǒng)在變形鏈球菌的生理活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，但究竟是LuxS蛋白在細(xì)菌轉(zhuǎn)甲基和蛋氨酸循環(huán)中所起的作用，還是LuxS/AI-2群體感應(yīng)機(jī)制引起的變化，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。Hasona等[19]用基因芯片分析LuxS蛋白表達(dá)下降的變形鏈球菌，發(fā)現(xiàn)包括分子伴侶、蛋白酶、細(xì)胞被膜合成酶、DNA修復(fù)和復(fù)制酶的81個(gè)蛋白基因表達(dá)上調(diào)，而與細(xì)胞感受態(tài)相關(guān)的基因、核糖體蛋白、與氨基酸和蛋白的生物合成酶有關(guān)的35個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。Sztajer等[20]將LuxS的代謝功能與AI-2信號(hào)分子的功能分離研究，培養(yǎng)luxS缺失的變形鏈球菌UA159，并加入化學(xué)合成的DPD，發(fā)現(xiàn)585個(gè)基因表達(dá)受影響(占基因組的30%)，這種變化不能由信號(hào)分子AI-2恢復(fù)，因此不是受群體感應(yīng)的影響，而是由于LuxS酶不能在甲基轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的過程中發(fā)揮作用所致。細(xì)菌中幾乎所有功能酶都受到影響，包括與生物膜形成、桿菌素合成、感受態(tài)和耐酸性相關(guān)的酶。同時(shí)，有59個(gè)基因在添加AI-2后轉(zhuǎn)錄改變，這些基因與蛋白合成、細(xì)胞張力、分裂有關(guān)。其中有3個(gè)與已知的AI-2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加。因此luxS缺失會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)菌的基因和表型變化，LuxS蛋白對(duì)細(xì)菌的基因表達(dá)和細(xì)菌多種蛋白的功能有直接調(diào)節(jié)作用。而LuxS催化形成AI-2信號(hào)分子，通過LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)菌生物膜中細(xì)菌的生物學(xué)行為，也能夠有效地促使細(xì)菌檢測種群的密度變化，并通過改變細(xì)菌的狀態(tài)來調(diào)整群體細(xì)菌的種類和密度。

5.問題與展望

變形鏈球菌LuxS蛋白調(diào)控變形鏈球菌基因表達(dá)，并催化形成AI-2信號(hào)分子，是群體感應(yīng)效應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白。LuxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)在調(diào)控細(xì)菌生物膜形成、糖代謝、耐酸性、耐藥性等方面有重要作用。近年來防齲研究主要集中于以PAc，GTFs和GBPs為疫苗靶點(diǎn)的抗齲疫苗研究[21]，盡管目前對(duì)LuxS蛋白具體的調(diào)控機(jī)制和LuxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)的傳導(dǎo)途徑還不明確，但不管是針對(duì)LuxS蛋白還是LuxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)的研究，都可以使我們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)口腔細(xì)菌生存的生理機(jī)制，并且成為口腔致齲菌藥物治療的新靶點(diǎn)、新途徑。

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