牛蛙消化道黏膜5種酶的分布

韋金鑫 郭 慧 宋 華 周乃珍 魏 超 張盛周

(安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,生物環(huán)境與生態(tài)安全省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蕪湖 241000)

牛蛙(Rana catesbeinana)隸屬兩棲綱無(wú)尾目蛙科蛙屬,是一種大型蛙,其生長(zhǎng)速度快,肉質(zhì)細(xì)嫩,肉味鮮美,是低脂肪高蛋白的高級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品。在我國(guó),牛蛙的人工養(yǎng)殖已得到了大規(guī)模推廣。目前對(duì)牛蛙的一般生物學(xué)研究較多,在消化酶方面,奚剛等[1]對(duì)牛蛙幼體發(fā)育階段消化道蛋白酶和淀粉酶的活力變化進(jìn)行了研究,朱聯(lián)九等[2]對(duì)成體牛蛙消化液中主要消化酶的活力進(jìn)行了研究,但牛蛙消化道黏膜中與消化吸收相關(guān)酶的分布尚未見(jiàn)報(bào)道。本文擬對(duì)牛蛙消化道黏膜堿性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)、ATP酶、酯酶和脂酶等5種酶的分布進(jìn)行研究,旨在增進(jìn)對(duì)牛蛙消化機(jī)能的認(rèn)識(shí),為牛蛙的人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.材 料

成體牛蛙6只,重250-300 g,取自蕪湖市南陵縣仙坊鎮(zhèn)牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)。穿刺毀髓,解剖,迅速取出完整消化道,用生理鹽水快速洗凈,按下列各部位取材:食道、胃賁門(mén)部、胃體、胃幽門(mén)部、十二指腸、空腸、回腸和直腸,置于-70℃的冰箱冷凍。參照田玉旺等[3]的方法制作冰凍切片,切片厚度7μm。甲醇固定5-10min,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.組 織化學(xué)染色方法

酶的組織化學(xué)方法參照文獻(xiàn)[3]中進(jìn)行,略有改變。

2.1 ALP ALP作用液成分為堿性磷酸酶緩沖液 (100mmol/L NaCl、5mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl,pH 9.2-9.4)、5% 四唑硝基藍(lán)(NBT)和5%5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(BCIP)。將組織切片浸于作用液顯色20min,蒸餾水浸洗。陽(yáng)性反應(yīng)呈藍(lán)紫色。

2.2 ACP ACP作用液成分為0.2mol/L醋酸緩沖液(p H 4.7)、5%Pb(NO3)2、3.2%β-甘油磷酸鈉。37℃條件下,將組織切片浸于作用液中孵育2h。蒸餾水浸洗數(shù)次,再浸入1%(N H4)2S溶液作用2-3min。蒸餾水浸洗后蘇木精復(fù)染。陽(yáng)性反應(yīng)呈棕色或棕黑色。

2.3 ATP酶 ATP酶作用液成分為三磷酸腺苷鈉鹽、0.2mol/L Tris-HCl緩沖液(p H 7.2)、2%Pb(NO3)2、0.1mol/L MgSO4混合后取得的上清液,將組織切片浸于作用液中孵育1-3h,蒸餾水浸洗3次,在1%硫化銨中浸1min,蒸餾水洗凈。陽(yáng)性反應(yīng)呈棕黃色。

2.4 酯酶 酯酶作用液成分為α-醋酸萘酯、PBS、Schiff’s試劑。將組織切片浸于作用液中孵育1h,流水沖洗,蘇木精復(fù)染,蒸餾水洗凈。陽(yáng)性反應(yīng)呈紅棕色。

2.5 脂酶 脂酶作用液成分為0.5mol/L Tris緩沖液(p H 7.2-7.4)、10%CaCl2、5%Tween-80。將組織切片置于作用液中孵育3-12 h,蒸餾水浸洗3次,浸入1%Pb(NO3)2溶液中15min,再在1-2%(N H4)2S中浸1-2min,蘇木精復(fù)染,蒸餾水洗凈。陽(yáng)性反應(yīng)部位出現(xiàn)棕黑色沉淀顆粒。

3.光 密度測(cè)定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在Olympus BX61型顯微鏡下觀(guān)察拍照,采用Image-Pro Plus圖像分析軟件對(duì)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行光密度分析,測(cè)出切片中陽(yáng)性部位的累積光密度(integrated optical density,IOD)和面積,算出平均光密度(mean optical density,MOD)。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性比較,P<0.05為差異顯著。

結(jié) 果

光鏡下,消化酶的分布部位呈現(xiàn)明顯的組織化學(xué)染色反應(yīng),經(jīng)光密度定量分析后,牛蛙消化道黏膜ALP、ACP、ATP酶、酯酶和脂酶等5種酶的分布見(jiàn)表1。

表1 牛蛙消化道黏膜5種酶的分布Table 1 Distribution of five types of enzymes in the gastrointestinal mucosa ofRana catesbeinana

1.A LP

ALP陽(yáng)性部位呈藍(lán)紫色(圖1)。十二指腸、空腸和回腸酶活力顯著較高(P<0.01),是ALP的主要分布部位;食道和直腸其次,賁門(mén)、胃體和幽門(mén)呈弱陽(yáng)性,酶活力顯著較低(P<0.01)。ALP主要位于消化道黏膜上皮層,集中于腸上皮細(xì)胞頂部的紋狀緣。

2.A CP

ACP陽(yáng)性部位呈棕黑色(圖2)。賁門(mén)、胃體和幽門(mén)酶活力顯著較高(P<0.01),是ACP的主要分布部位;食道和腸道各段呈弱陽(yáng)性,酶活力顯著較低(P<0.01)。ACP主要位于胃黏膜上皮層細(xì)胞內(nèi)。

3.A TP酶

A TP酶陽(yáng)性部位呈棕黃色(圖3,4)。消化道各段均顯示出較高的A TP酶活力。在十二指腸、空腸和回腸酶活力顯著較高(P<0.01),賁門(mén)、胃體和幽門(mén)其次,食道和直腸酶活力顯著較低(P<0.05)。ATP酶主要位于消化道的肌層和上皮細(xì)胞層,胃腺上皮亦有較多分布。

4.酯 酶

酯酶陽(yáng)性部位呈紅棕色(圖5)。十二指腸、回腸和直腸酶活力顯著較高(P<0.01),賁門(mén)、胃體、幽門(mén)和空腸其次,食道酶活力顯著較低(P<0.05)。酯酶位于消化道黏膜上皮細(xì)胞頂部。

5.脂 酶

脂酶的陽(yáng)性部位具棕黑色沉淀顆粒(圖6)。十二指腸、空腸和回腸酶活力顯著較高(P<0.01),胃體、幽門(mén)部和直腸其次,食道和賁門(mén)酶活力顯著較低(P<0.05)。脂酶主要位于消化道黏膜上皮細(xì)胞層和消化腔內(nèi)。

討 論

消化酶的分布是反映動(dòng)物消化道不同部位消化吸收機(jī)能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。目前,對(duì)低等脊椎動(dòng)物消化道黏膜消化酶分布的研究主要集中在經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖型魚(yú)類(lèi)[4-8],蛙類(lèi)的研究報(bào)道較少。本研究應(yīng)用酶的組織化學(xué)方法對(duì)牛蛙消化道黏膜5種重要消化酶的分布進(jìn)行了研究。

ALP是一種在動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的非特異性磷酸水解酶,魚(yú)類(lèi)消化道ALP主要分布于腸道各段[4-8],本研究顯示牛蛙消化道ALP主要分布于十二指腸、空腸和回腸,與魚(yú)類(lèi)基本一致。ALP不僅與有機(jī)磷的代謝、蛋白質(zhì)及脂類(lèi)的代謝有關(guān),還參與主動(dòng)運(yùn)輸和吸收過(guò)程[9,10],是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的標(biāo)志酶[7]。牛蛙消化道ALP活性集中于腸上皮細(xì)胞頂部紋狀緣處,與其參與腸上皮細(xì)胞的吸收功能相一致。ALP的分布表明十二指腸、空腸和回腸是牛蛙消化道主要吸收部位。

ACP是一種廣泛分布于生物界的磷酸酯酶,常存在于細(xì)胞的溶酶體內(nèi)。魚(yú)類(lèi)ACP在胃和腸道各段均有分布[4-8],褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)[4]和許氏平鲉(Sebastes schlegeli)[5]腸道ACP的活性明顯高于胃,本研究則顯示牛蛙消化道ACP主要分布于胃,腸道各段ACP活力很低。ACP需在酸性條件下發(fā)揮作用,牛蛙消化道ACP的分布與魚(yú)類(lèi)不同可能與牛蛙消化道各段的分化程度較魚(yú)類(lèi)高有關(guān)。ACP是溶酶體的標(biāo)志酶,主要參與細(xì)胞內(nèi)消化作用[4,5],牛蛙胃上皮具有較強(qiáng)的ACP活力,顯示其具有一定的細(xì)胞內(nèi)消化功能。

ATP酶是位于細(xì)胞膜上的一種糖蛋白,主要參與維持細(xì)胞膜內(nèi)外的離子梯度差,參與腸上皮細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收作用[11,12]。牛蛙消化道A TP酶主要分布于十二指腸、空腸和回腸進(jìn)一步表明其是牛蛙消化道主要吸收部位。有報(bào)道認(rèn)為ATP酶還介導(dǎo)了蛙類(lèi)胃蛋白酶和胃酸的分泌[12],本研究發(fā)現(xiàn)牛蛙胃腺上皮細(xì)胞中有較高的ATP酶活力,從形態(tài)學(xué)上支持了上述結(jié)果。

酯酶和脂酶分別參與酯類(lèi)和脂類(lèi)的消化作用。酯酶在不同魚(yú)類(lèi)消化道分布差異較大,褐菖鲉消化道酯酶主要分布于胃,食道和腸道僅有微弱的酯酶活性[4],許氏平鲉[5]和大菱鲆(Scophthalmus maximus)[6]酯酶則主要分布于腸道,歐洲無(wú)須鱈(Merluccius merluccius)[7]酯酶在消化道各段均有分布,腸道中酯酶活性明顯較高。魚(yú)類(lèi)的脂酶主要分布于胃和腸道[6,8]。本研究發(fā)現(xiàn)牛蛙的酯酶和脂酶均在消化道各段都有分布,且均以腸道酶活性顯著較高,與朱聯(lián)九等[2]的生化分析測(cè)定結(jié)果相一致,進(jìn)一步顯示腸道是牛蛙對(duì)脂質(zhì)的主要消化部位。

綜上所述,牛蛙消化道黏膜酶的分布同其它物種有相似之處,也有其自身特點(diǎn)。十二指腸、空腸和回腸是牛蛙的主要消化吸收部位。

[1]奚剛,許梓榮,錢(qián)利純,等.牛蛙幼體消化酶活力及其機(jī)體主要營(yíng)養(yǎng)成分的研究.經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),1993,3(3):50-56

[2]朱聯(lián)九,朱升學(xué),程文娟,等.牛蛙主要消化酶的分布及p H和溫度對(duì)消化酶活力的影響.激光生物學(xué)報(bào),2008,17(4):496-501

[3]田玉旺,李琳,朱紅艷,等.提高冷凍切片制片質(zhì)量的方法探討.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2010,19(4):408-410

[4]楊景山.醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物技術(shù).北京:北京醫(yī)科大學(xué)與中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1992

[5]石戈,王健鑫,劉雪珠,等.褐菖鲉消化道的組織學(xué)和組織化學(xué).水產(chǎn)學(xué)報(bào),2007,31(3):293-302

[6]馮曉燕,鄭家聲,王梅林.許氏平鲉消化道的組織化學(xué)研究.青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2003,33(3):399-404

[7]崔龍波,周雪瑩,呂虹,等.大菱鲆消化系統(tǒng)的組織學(xué)和組織化學(xué)研究.海洋水產(chǎn)研究,2008,29(6):47-51

[8]Kozaric Z,Kuzir S,Nejedli S,et al.Histochemical distribution of digestive enzymes in hake,Merluccius mer-luccius L.1758.Vet Arhiv,2004,74(4):299-308

[9]Mir IH,Channa A.Histochemical distribution of lipase and acid phosphatase in the intestinal tract of the Snow Trout,Schizothorax curvifrons heckel.J Biol Sci,2010,10(7):643-647

[10]Lallès J P.Intestinal alkaline phosphatase:multiple biological roles in maintenance of intestinal homeostasis and modulation by diet.Nutr Rev,2010,68(6):323-332

[11]Kaplan J H.Biochemistry of Na,K-ATPase.Annu Rev Biochem,2002,71:511-535

[12]Liquori GE,Zizza S,Mastrodonato M,et al.Pepsinogen and H,K-ATPase mediate acid secretion in gastric glands of Triturus carnifex(Amphibia,Caudata).Acta Histochem,2005,107(2):133-141

圖 版 說(shuō) 明

圖1 十二指腸堿性磷酸酶,位于腸上皮細(xì)胞頂部的紋狀緣;

圖2 胃體酸性磷酸酶,位于胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi);

圖3 胃幽門(mén)ATP酶,位于胃腺上皮細(xì)胞;

圖4十二指腸ATP酶,位于肌層和上皮細(xì)胞;

圖5十二指腸酯酶,位于上皮細(xì)胞頂部;

圖6十二指腸脂酶,位于黏膜上皮細(xì)胞層和消化腔內(nèi)。Ep:上皮 ;GG:胃腺;ML:肌層;標(biāo)尺 =100μm

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 ALP in duodenum,localized in the brush border of epithelial cells

Fig.2 ACP in stomachus corpus,localized in the epithelial cells of gastric mucosa

Fig.3 ATPase in stomachus pyloricus,localized in the epithelial cells of gastric glands

Fig.4 ATPase in duodenum,localized in the muscular layer and the epithelial cells of mucosa

Fig.5 Eterase in duodenum,localized in the apical portions of the epithelial cells

Fig.6 Lipase in duodenum,localized in the epithelial cells and the digestive cavity. Ep:epithelium;GG:gastric gland;ML:muscular layer;Scale bar=100μm