雌激素削弱同型半胱氨酸誘導(dǎo)的N2a細(xì)胞Tau和NgR共表達(dá)

童 飛 魯亞平 朱 勇 許家玉 曹永才

(安徽省無為縣畜牧局安徽 238300)

Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞主要的微管相關(guān)蛋白(microtubule associated protein,MAP),Tau蛋白高度磷酸化,形成成對(duì)螺旋絲(paired helical filament,PHF),并以纖維絲團(tuán)形式堆積在神經(jīng)元內(nèi),形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT),使神經(jīng)元產(chǎn)生退行性變[1]。Nogo-66 receptor(NgR)被確認(rèn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous cystem,CNS)損傷后抑制再生的膜受體[2]。血漿中 Hcy水平:5～15μmol/L 為正常、16～30μmol/L 為輕度增高、31～100μmol/L 為中度增高、>100μmol/L 則為重度增高[3]。在許多神經(jīng)疾病中,Hcy在腦中積聚,是潛在的神經(jīng)毒素,超量的高半胱氨酸增加阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)病率[4,5],但機(jī)制卻不清楚。王建枝等通過大鼠尾靜脈注射高半胱氨酸兩個(gè)星期,在大鼠的海馬檢測(cè)到了AD樣Tau過度磷酸化[6]。

在這里我們采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),用100μmol/L的高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)在不同的時(shí)間段(0.5h、5h)誘導(dǎo) N2a細(xì)胞,促使 Tau蛋白的過度磷酸化,建立神經(jīng)細(xì)胞 Tau過度磷酸化模型,檢測(cè)用100nM的雌激素(17β-estradiol,E2)預(yù)處理過的N2a細(xì)胞NgR的表達(dá)變化。在體外已證明雌激素最佳實(shí)驗(yàn)濃度在1-100nM之間[7],為此我們用100nM的雌激素預(yù)處理小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系(Neuro2A,N2a)。本研究應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)法觀察了Hcy誘導(dǎo)組以及用17β-雌二醇預(yù)處理后N2a細(xì)胞Tau蛋白和NgR的共表達(dá)變化,旨在為臨床上應(yīng)用雌激素替代療(estrogen replacement therapy,ERT)法預(yù)防因雌激素缺乏或斷絕而導(dǎo)致的神經(jīng)元功能衰退性疾病的發(fā)生,探討雌激素對(duì)神經(jīng)再生作用的機(jī)制及意義提供點(diǎn)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1主 要試劑與儀器

小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞系(N2a)(周江寧教授贈(zèng)予,中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)),DMEM(美國 GIBCO公司),胎牛血清 (FBS,美國 GIBCO公司),100 IU的青霉素和鏈霉素(美國 GIBCO公司),60mm的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning Incorporated,USA),60 mm×15mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿(CorningIncorporated,USA),p-Tau(ser-396)羊多克隆抗體、Nogo-R(H-120)兔多克隆抗體、生物素標(biāo)記的牛抗兔 IgG-B、生物素標(biāo)記的驢抗羊Ig-B分別購于美國Santa Cruz公司,streptavidin-FITC(Biolegend),Cy3-labeled streptavidin(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD),同型半胱氨酸 (Hcy)、17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)分別購于美國Sigma公司。

2實(shí) 驗(yàn)分組與細(xì)胞模型的建立

實(shí)驗(yàn)前一天,將N2a細(xì)胞系種到兩塊60mm的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,每孔內(nèi)各放一個(gè)經(jīng)多聚賴氨酸處理過的蓋玻片,隔一天換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分成4組:第1組為空白對(duì)照組(兩孔),第2組加入100μM Hcy 0.5小時(shí)組(四孔),第3 組加入100μM Hcy 5小時(shí)組(四孔),第4組先用100nM 的 E2預(yù)處理2小時(shí)后再加入100μM Hcy誘導(dǎo)5小時(shí)組(兩孔)。以上所有操作均在相同的條件下進(jìn)行。

3 p-Ta u和NgR 的免疫熒光雙標(biāo)法

細(xì)胞爬片后取出,冰DPBS洗3×5min;4%多聚甲醛固定10分鐘(4度冰箱中);ddH2O洗3×5min;3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,室溫下10min;DPBS溶液洗3×5min;5%羊血清室溫下封閉1h,減少非特異性抗體的干擾;甩去血清(不洗),一抗Nogo-R兔抗人多克隆抗體(1:200)37℃孵育1h;DPBS溶液洗3×5min;滴加生物素連接(?？雇?的二抗(1:200)含5%羊血清37℃孵育30min;DPBS溶液洗3×5min;滴加Cy3-labeled streptavidin(1:500)(5μg/ml)37℃孵育1 hour(以下步驟在黑暗中進(jìn)行!);DPBS溶液洗3×5min;細(xì)胞片浸入0.05 mol/L的glycine-HCl-buffered saline(p H 2.2)室溫下1 hour,來淬滅多余的抗體;DPBS溶液洗3×10min;滴加一抗p-Tau羊多克隆抗體(1:200)37℃孵育1h;DPBS溶液洗3×10min;滴加生物素連接(驢抗羊)的二抗(1:200,containing 5%normal goat serum)37℃孵育30min;DPBS溶液洗3×5min;滴 加 Streptavidin-FITC(1:200)(5μg/ml)37℃孵育30min;DPBS溶液洗3×5min;90%甘油封片;OL YMPUS IX51(Tokyo,Japan)熒光倒置顯微鏡下觀察和拍照。

4圖 像分析及數(shù)據(jù)處理

用Image Pro Plus 5.1.1(Media Cybernetics.Silver Spring,MD,USA)軟件分別測(cè)出每組中每張片子上任意五個(gè)細(xì)胞p-Tau和NgR的免疫熒光強(qiáng)度值,顯微鏡放大倍數(shù)為400,所有照片經(jīng)過背底一致化處理,數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。所得數(shù)據(jù)由SPSS13.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件作單因素方差檢驗(yàn)分析(表1),最后用Origin7.5(OriginLab,USA)軟件作直方圖分析(P<0.05被認(rèn)為有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。

表1 比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組NgR和p-Tau免疫熒光強(qiáng)度值Table 1 Compared the experimental groups and control groups NgR and p-Tall immunofluorescence intensity

圖2 NgR和p-Tau的免疫熒光雙標(biāo)(×400) 圖A,D,G,J綠色示p-Tau的免疫陽性反應(yīng)(×400);圖B,E,H,K紅色示NgR的免疫陽性反應(yīng)(×400); 圖C,F,I,L黃色示兩者的共表達(dá) (×400); 圖A,B,C分別是對(duì)照組的p-Tau、NgR的免疫陽性結(jié)果和共標(biāo); 圖D,E,F分別是0.5h組的p-Tau、NgR的免疫陽性結(jié)果和共標(biāo); 圖 G,H,I分別是5h組的p-Tau、NgR的免疫陽性結(jié)果和共標(biāo);圖J,K,L分別是 E2+5hHcy組的p-Tau、NgR的免疫陽性結(jié)果和共標(biāo)。Fig.A,D,G,J showing p-Tau immunoreactivity(green)expressed in N2a cells(×400). Fig.B,E,H,K showing NgR immunoreactivity(red)expressed in N2a cells(400×). Fig.C,F,I,L showing p-Tau and NgR immunoreactivity coexpressed in N2a cells(400×). Fig.A,B,C NgR and p-Tau immunoreactivity rarely co-expressed in control groups. Fig.D,E,F Showing much more p-Tau and NgR co-expressed in the N2a cells in 0.5 groups. Fig.G,H,I Showing high expression of p-Tau and NgR in the N2a cells in 5h groups. Fig.J,K,L Displaying fewer p-Tau and NgR immunoreactivity expressed in the N2a cells in E2+5h groups.

圖3 NgR和p-Tau的免疫熒光雙標(biāo)(×800) ①,②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧分別取自圖2中的 A,B,D,E,G,H,J,K;①,③,⑤,⑦箭頭顯示p-Tau的免疫陽性結(jié)果都廣泛分布于N2a細(xì)胞的胞膜、胞質(zhì)和突起上(比例=100:1); ②,④,⑥,⑧顯示NgR的免疫陽性結(jié)果廣泛分布于N2a細(xì)胞的胞膜,對(duì)照組(圖②)中主要在核內(nèi)(比例=100:1)。Fig.3:①,②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧were taken from Fig.2:A,B,D,E,G,H,J,KThe arrows of①,③,⑤,⑦show that the p-Tau’s immunopositive results are widely distributed in the N2a cell membrane,cytoplasm,and neurodendrite;②,④,⑥,⑧show the results of NgR immunopositive widely distributed in the N2a cell membrane,but in the control groups it mainly in the nucleus(figure②).

結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)采用免疫熒光技術(shù),結(jié)果顯示在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中p-Tau的免疫陽性結(jié)果都廣泛分布于N2a細(xì)胞的胞膜、胞質(zhì)和突起上,細(xì)胞核中很少分布。NgR的免疫陽性結(jié)果與p-Tau類似,但它主要分布于神經(jīng)元的胞膜、胞質(zhì)和胞核,很少有全細(xì)胞分布(見圖2、圖 3)。在 Hcy誘導(dǎo)后5h組 N2a細(xì)胞中Tau蛋白和NgR蛋白的共表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組相比有較大差異(P<0.01)(見表1)。用100nM 的 E2預(yù)處理2小時(shí)后再加入 Hcy誘導(dǎo)5小時(shí)組與對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)。

討 論

我們發(fā)現(xiàn)NgR廣泛分布于N2a細(xì)胞,與對(duì)照組相比高濃度 Hcy誘導(dǎo)0.5h和5h時(shí)NgR免疫活性明顯增強(qiáng)(P<0.01)。這說明高濃度 Hcy在這一損傷過程中起了至關(guān)重要的作用。NgR是神經(jīng)元表面受體,它是三種抑制性蛋白:Nogo-A、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)的共同受體,并與它們發(fā)生作用抑制軸突的再生[2,8,9]。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中NgR免疫陽性結(jié)果主要分布于細(xì)胞核,或許 NgR和p75NTR、APP(Aβprecursor protein)一樣 ,可以被α-和γ-分泌酶剪切,釋放出細(xì)胞外的NgR片段(the extracellular NgR,NgR ECD)和細(xì)胞內(nèi)的NgR片段(the intracellular NgR,NgR ICD)[10]。NgR被神經(jīng)分泌酶剪切后神經(jīng)抑制信號(hào)被切斷,軸突再生的抑制被解除[11,12,13]。這或許是神經(jīng)瘤細(xì)胞能無限增殖的原因之一。同型半胱胺酸又稱為高半胱氨酸,是蛋氨酸和半胱胺酸代謝過程中一個(gè)重要的中間產(chǎn)物。近年大量研究發(fā)現(xiàn),阿爾茨海默病(AD)患者存在高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia,HHcy),Hcy與AD的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[14,15]。細(xì)胞內(nèi) Hcy濃度的升高可引起tau蛋白的高磷酸化[16]。

本實(shí)驗(yàn)的P-Tau是羊多克隆抗體用來檢測(cè)tau蛋白在Ser396位置的磷酸化,Hcy處理N2a細(xì)胞后多數(shù)NgR和p-Tau共表達(dá)于細(xì)胞中,這也暗示著NgR可能與tau蛋白的過度磷酸化進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)著。我們發(fā)現(xiàn)NgR廣泛分布于N2a細(xì)胞中,與對(duì)照組相比高濃度 Hcy處理0.5h和5h時(shí)NgR免疫活性明顯增強(qiáng)(P<0.01),雌激素預(yù)處理組N2a細(xì)胞 Tau蛋白和NgR的表達(dá)減少,甚至恢復(fù)到原有水平。這說明高濃度 Hcy在這一損傷過程中起了至關(guān)重要的作用,而雌激素可以明顯地拮抗 Hcy對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。此過程中,雌激素可能主要通過抑制糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3,GSK-3β)并與雌激素受體(estrogen receptor,ER)、β-catenin結(jié)合后,通過細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)作用削弱 Tau蛋白的過度磷酸化[7,17],從而減輕了神經(jīng)細(xì)胞的損傷,引起NgR表達(dá)下調(diào)。雌激素在體內(nèi)具有廣泛的生物學(xué)活性,它對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的作用可能還受到遺傳和環(huán)境依賴,其機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

這里暗示對(duì)于絕經(jīng)后或因卵巢腫瘤切除卵巢患者實(shí)施雌激素取代治療能減少或延遲AD的發(fā)生。我們應(yīng)高度重視雌激素的作用,增加它們的供應(yīng),從源頭上預(yù)防和治療Hcy引起的相關(guān)疾病的發(fā)生。

致謝

感謝中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)周江寧教授提供的N2a細(xì)胞系;感謝安徽師范大學(xué)魯亞平教授給予實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

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