抑制自噬促進冬凌草甲素誘導的多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡涉及胞內ROS產生

曾 蓉 陳 燕 崔國惠

(華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所,湖北武漢 430022)

冬凌草甲素 (oridonin,Ori),為一類雙萜類化合物,提取自碎米椏植物中,具有多種藥理和生理作用,例如抗炎和抗菌作用等,其在抗腫瘤方面的作用研究逐漸成為熱點[1-3]。至今為止,一些體內外實驗均證實冬凌草甲素可以誘導某些腫瘤細胞發(fā)生凋亡和自噬[4-6],但是關于兩者之間的關系、兩者對腫瘤細胞生存的影響以及涉及的分子機制研究才剛剛起步。

自噬是一通過溶酶體分解胞質成分的過程,主要有3種形式的自噬:巨自噬(以下簡稱自噬);微自噬以及伴侶分子介導的自噬。自噬由一系列連續(xù)步驟完成,以自噬小體的形成為特征[7,8]。隨著各種自噬相關基因的發(fā)現(xiàn),自噬的分子過程也逐漸清晰,在眾多的自噬相關基因中最為重要的基因包括Beclin1和LC3。Beclin1為Atg6的同源類似物,介導自噬起始[9-11]。微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),為Apg8p的同源類似物,其在自噬小體膜形成中至關重要。LC3具有兩種形式-LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ主要以彌漫的形式位于胞漿中,當自噬發(fā)生時,被處理為LC3-Ⅱ并參與構成自噬小體膜,在細胞內以點簇狀形式存在,因此Beclin1的蛋白表達水平以及LC3-Ⅱ自噬小體膜定位通常用來作為判斷自噬水平的指標[9-11]。凋亡——程序性細胞死亡Ⅰ型(PCDⅠ),是一種受基因調控的細胞自殺過程,其形態(tài)學特征為核膜周邊染色質凝集、核凝集、細胞器保留比較完整以及吞噬小體的缺失。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)是一類生存周期短、具有活性的含氧化合物,主要包括超氧陰離子、氧自由基、過氧化合物等。雖然在線粒體在正常氧化呼吸時也不可避免的產生少量的ROS,在生理狀態(tài)下低水平的ROS能被一些抗氧化酶和物質降解,然而中、高度的ROS產生導致ROS胞內蓄積從而引起氧化應激反應。ROS能直接氧化蛋白、脂質以及DNA引起一系列細胞反應。大量研究已經證實ROS產生通過增加線粒體膜通透性直接啟動凋亡[12,13]。

本實驗研究了冬凌草甲素作用于多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞誘發(fā)自噬和凋亡,兩者之間的關系以及ROS的作用。

材料和方法

1.材 料

人多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226細胞購自ATCC;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、冬凌草甲素、3-甲基腺素(3-MA)、NAC(N-Acetyl-L-cysteine,N-乙酰-L-半胱氨酸)、DCFH-DA(2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽)熒光探針、抗人單克隆抗體γ-tubulin購自美國Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)液購自美國 Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;凋亡試劑盒(TUNEL)購自博士德生物有限公司;抗人單克隆抗體LC3購自美國Abcam公司;抗人多克隆抗體Beclin1購自美國Santa cruz公司。

2.方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。當細胞到達對數(shù)生長期后,用相應濃度的Ori處理細胞。Ori處理前1h加入5m mol/l NAC預處理,用以抑制胞內ROS產生。Ori處理前1h加入5m mol/l 3-MA預處理,用以抑制自噬。

2.2 MTT比色實驗

用含10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基將RPMI8226細胞配成單個細胞懸液,以每孔1×105/ml的濃度接種于96孔板中,每孔體積200μl。將接種細胞的96孔板置于CO2培養(yǎng)箱中,以37℃、5%CO2、飽和濕度分別培養(yǎng)12h、24h和48h,Ori的工作濃度分別為 1、2、4、8、16、32、64μmol/l。細胞經實驗處理后,每孔加入20μlMTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4h。結束后,平板離心機以1000rpm轉速離心5min,小心吸棄上清,于每孔中加入150μl DMSO,振蕩并充分溶解結晶15min。選擇激發(fā)波長490nm,參考波長650nm,在 ELX800型酶標儀上分析各孔光密度(OD)值,并記錄計算細胞增殖抑制率:(對照組OD值–對照調零組OD值)– (實驗組OD值– 實驗調零組OD值)/(對照組OD值–對照調零組OD值)×100。

2.3 脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡

收集經10μmol/l Ori處理24h的細胞,并以未經Ori處理的細胞作為對照,根據(jù)使用說明進行實驗。在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果,顯微鏡下共計數(shù)500個細胞,計算調亡率:凋亡率(%)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%

2.4 利用QDs605nm-Anti-LC3熒光探針免疫熒光定位LC3

(1)QDs605nm-Anti-LC3熒光探針制備:根據(jù)武漢大學化學和生物分子學院提供的步驟進行熒光探針制備[14]。簡要步驟如下:用巰基乙酸活化過的QDs605nm溶解于含50 mmol N-(3-二甲基胺基丙基)-N’-乙基碳二亞胺 氯化氫和5 mmol N-羥基丁二酰亞胺的 PBS中;接著于20μl抗人LC3單克隆抗體在室溫下振蕩孵育2-4h;6000g室溫離心10分,獲取上清并微孔透析 8-12h獲得較純的QD605nm-Anti-LC3探針,4℃保存。

(2)免疫熒光反應:收集經實驗處理后的細胞,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛4℃固定1h;PBS洗滌2次,將細胞涂于經1%明膠預先包被過的載玻片上,在超凈工作臺上干燥制片;用0.1%Triton X-100滴于載玻片細胞面,在室溫下破膜10分;接著將終濃度為 1×10-7mol/l的 QD605nm-Anti-LC3探針溶液滴加在載玻片細胞面,室溫孵育4h;PBS洗3次,封片。

(3)熒光顯微鏡下觀察:以605nm激發(fā)波長觀察,LC3-Ⅰ在胞漿內彌散分布,LC3-Ⅱ呈點簇狀分布,故紅色的斑點狀熒光表示LC3-Ⅱ的自噬小體膜定位。至少計數(shù)500個細胞并計算紅色斑點狀熒光陽性細胞率%:紅色斑點狀熒光陽性細胞率%=紅色斑點狀熒光陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100。

2.5 免疫印記實驗

利用western blot檢測細胞Beclin1蛋白水平,收集經實驗處理的細胞,用預冷的 PBS洗滌2次,然后重懸于細胞裂解液,于冰上裂解30min,期間超聲裂解 3次,裂解后在 4℃以 12000rpm離心15min,收集上清即總蛋白質液。用BCA法測定蛋白濃度后,用5×上樣緩沖液(終濃度為1×)和雙蒸水稀釋各蛋白樣品至同一濃度備用。取等量的蛋白樣品進行 SDS-PAGE電泳、轉膜、抗體孵育等步驟后,用 ECL孵育后,X光膠片曝光,曝光顯影的目的條帶用ImageJ image處理軟件進行半定量分析,以內參為參考標準計算出目的條帶標準化后的光密度值,并以此判斷蛋白的表達水平。

2.6 測量胞內ROS產生

收集經實驗處理后的細胞,RPMI1640洗滌2次。細胞重懸于終濃度為25μmol/L DCFH-DA溶液中,輕輕吹打混勻,37℃孵育30min。DCFH-DA探針裝備完成后,用 RPMI1640培養(yǎng) 洗滌細胞2次,用流式細胞術以激發(fā)波長488nm,用一波長為515 nm的通帶濾器檢測DCF熒光。

2.7 統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 13.0做統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±S.D.)表示,組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.冬 凌草甲素抑制RPMI8226細胞增殖

分別以 1、2、4、8、16、32 umol/L 的 Ori作用于RPMI8226細胞12h、24h和48h。根據(jù)MTT分析,如圖1所示,Ori能明顯抑制細胞增殖,其細胞增殖抑制作用呈時間-、劑量-依賴性,其48h的 IC50為5.16μmol/L。

圖1 Ori對RPMI8226細胞增殖抑制作用的時效、量效分析不同濃度的 Ori(1、2、4、8、16、32u mol/L)分別作用 RPMI8226細胞12h,24h和48h。Fig.1 Assessment of time-and dose-effect of proliferative inhibition induced by Ori in RPMI8226 cellsRPMI8226 cells were treated with Ori at various concentrations(1,2,4,8,16,32u mol/L)for 12h,24h and 48h.

2.冬 凌草甲素通過胞內ROS產生誘導RPMI8226細胞凋亡

利用TUNEL和流式細胞術分別檢測10μmol/L Ori作用0h,24h后RPMI8226細胞凋亡和胞內ROS水平。如圖2a所示,與0h相比,Ori處理24h后TUNEL陽性細胞顯著增多,計算凋亡率為58.91±3.43%,明顯高于0h(6.01±0.62%,P<0.01),表明Ori誘導細胞凋亡。如圖2b所示,隨著凋亡的增加,胞內ROS產生,24h細胞DCF平均熒光強度明顯高于0h(41018.27±392.71 versus 26853.33±587.44,P<0.01)。

為了進一步探討胞內ROS產生在Ori誘導凋亡過程中的作用,用5 mmol/L自由基清除劑NAC預處理細胞1h,然后Ori作用24h,重復上述實驗檢測胞內ROS水平和凋亡并與Ori處理組比較。如圖2b所示,與Ori處理組相比,NAC預處理組DCF平均熒光強度明顯下降至基礎水平(25899.81±601.71),NAC完全抑制了Ori導致的胞內ROS產生,同時細胞凋亡消失(5.93±1.13%)(見圖2a)。

以上結果說明胞內ROS產生對Ori誘導凋亡至關重要,換言之,Ori通過胞內ROS產生誘導細胞凋亡。

3.冬 凌草甲素誘導RPMI8226細胞自噬

利用QDs605nm-Anti-LC3熒光探針免疫熒光技術和western blot分別檢測 RPMI8226細胞經10μmol/L Ori處理0h,24h的LC3胞內定位和Beclin1蛋白水平。如圖3a所示,與0h相比,Ori作用24h紅色點簇狀熒光陽性細胞明顯增多,且紅色點簇狀熒光細胞陽性率也顯著升高(89.67±4.65%versus 14.13±3.05%)。Western blot檢測分析Beclin1的蛋白水平發(fā)現(xiàn)24h蛋白水平明顯高于0h(見圖3b)。以上結果說明Ori除了誘導凋亡外還能同時誘導細胞自噬。

圖2 Ori處理組、NAC預處理組和3-MA預處理組凋亡和胞內ROS產生變化RPMI8226細胞分別以10μmol/L Ori處理0h和24h、先以5m mol/L NAC或5m mol/L 3-MA預處理1h后經10μmol/L Ori處理 24h。(a)TUNEL檢測細胞凋亡;(b)流式細胞術分析DCF熒光強度。直方圖中的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±S.D,n=3)表示 ,＊P<0.05,＊＊P<0.01。Fig.2 Assessment of intracellular ROS level in Ori-treated,NAC-pretreated and 3-MA-pretreated groupsRPMI8226 cells were pre-treated with 5m mol/L 3-MA or NAC for 1h,and then treated with 10u mol/L Ori for 24h.Cells were alone-treated with 10μmol/L Ori for 0h and 24h.(a)apoptosis detected by TUNEL;(b)DCF fluorescent intensity analyzed by FCM.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D;＊P<0.05,＊＊P<0.01

圖3 Ori處理組和3-MA預處理組自噬變化

圖3 b western blot檢測Beclin蛋白水平并以γ-tubulin作為內參應用ImageJ image處理軟件進行半定量分析。直方圖中的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±S.D.,n=3)表示,＊＊P<0.01,＊P<0.05(b) Beclin1 protein levels were detected by western blot assay.γ-tubulin was used as an equal loading control.The bands were quantified by ImageJ image software.Columns,mean of three independent experiments;Error bars,±S.D.;＊P<0.05,＊＊P<0.01

4.在RPMI8226細胞中,胞內ROS產生參與了抑制自噬上調促進冬凌草甲素誘導細胞凋亡的過程

以上的實驗結果已經說明凋亡是Ori所致的細胞死亡的途徑之一,為了進一步探討自噬在細胞死亡中充當?shù)慕巧?以及自噬和凋亡之間的關系,自噬抑制劑3-MA引入了實驗研究,細胞先經5 mmol/L 3-MA預處理1h,然后10μmol/L Ori作用24h。重復上述實驗檢測自噬、凋亡和胞內ROS產生。如圖3a,b所示,3-MA預處理組紅色點簇狀熒光細胞陽性率(39.87±2.93%)以及Beclin1蛋白水平明顯低于Ori處理組(P<0.01)。如圖2a,b所示,3-MA預處理組調亡率(81.33±4.83%)和DCF平均熒光強度(59811.37±322.16)均明顯高于Ori處理組(P<0.05)。

上述結果表明自噬并非細胞死亡的途徑而充當細胞保護機制。抑制自噬通過上調胞內ROS產生促進Ori誘導的細胞凋亡。

討 論

冬凌草甲素,一種潛在的抗腫瘤藥物,已經證實在多種腫瘤細胞系中同時誘發(fā)自噬和凋亡,包括Hela細胞、A431細胞等[5,15]。自噬和凋亡之間的關系研究結果說法不一,普遍認為在不同的細胞中、不同的條件下,兩者之間的關系也隨之不同。Jia等人發(fā)現(xiàn)自噬對 TNF-α誘發(fā) T淋巴細胞白血病細胞凋亡至關重要,凋亡的發(fā)生依賴于自噬的發(fā)生[16]。在另外的實驗體系中,發(fā)現(xiàn)自噬拮抗或延緩凋亡,通過抑制自噬可以促進細胞凋亡[15,17]。在本實驗中,同樣發(fā)現(xiàn)Ori同時誘發(fā)RPMI8226細胞凋亡和自噬,利用公認的自噬抑制劑3-MA抑制自噬后,發(fā)現(xiàn)Ori誘導的細胞凋亡增加,說明雖然Ori同時誘導了細胞自噬和凋亡,但自噬抑制細胞凋亡,為細胞促生存機制,凋亡才是細胞死亡的主要途徑。

胞內ROS產生介導很多細胞生理和病理反應,高水平的ROS與細胞凋亡密切相關。ROS參與凋亡作用已經被大量的研究證實[12,13]。在本實驗中,Ori同時誘發(fā)胞內 ROS產生和凋亡,用NAC完全抑制胞內ROS后,凋亡也不能再被誘導,說明在此Ori誘導細胞凋亡是經 ROS介導的,且胞內 ROS產生是Ori誘導細胞凋亡的關鍵機制。有研究表明自噬能有效緩解胞內ROS產生緩解應激壓力發(fā)揮其促生存作用[20-21],在本研究中,利用3-MA抑制自噬后,細胞凋亡增加的同時胞內ROS水平也隨之進一步升高,說明胞內ROS產生參與了抑制自噬促進Ori誘導的凋亡的過程。以上發(fā)現(xiàn)為深入研究Ori治療多發(fā)性骨髓瘤的分子機制、靶點提供了新的契機。

綜上所述,在本實驗中發(fā)現(xiàn)Ori同時誘導細胞凋亡和自噬;胞內ROS產生是Ori誘發(fā)多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡的關鍵機制;闡明自噬通過緩和胞內ROS產生拮抗凋亡,為促進Ori抗腫瘤療效提供了一個可行的方案。以上研究結果提供有關Ori誘導凋亡和自噬機制的新信息,為MM的治療提供新思路。

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