波動(dòng)性高糖對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響

魯巧梅 劉曌宇

(1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院急診內(nèi)科; 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科武漢430030)

糖尿病心肌病是糖尿病患者所特有的心臟病,糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚。實(shí)驗(yàn)研究指出多種代謝紊亂構(gòu)成了糖尿病心肌功能和結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ)。糖尿病心肌病患者究竟是哪些因素啟動(dòng)和促進(jìn)了糖尿病性心肌病的發(fā)生與發(fā)展?有研究證明單純高糖可促進(jìn)心肌細(xì)胞代謝異常是其主要原因之一。然而,對(duì)于波動(dòng)性高糖是否會(huì)影響心肌細(xì)胞的肥大鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞的干預(yù),研究波動(dòng)性高糖是否與高糖一樣具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用。

材料和方法

1.材 料

出生2天SD大鼠乳鼠,雌雄不拘,由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。膠原酶為SERVA公司產(chǎn)品;高糖DMEM培養(yǎng)基、低糖DME培養(yǎng)基和小牛血清由 Hyclone公司提供;5-溴脫氧尿嘧啶(Brdu)由Sigma公司提供;3H-leucine為中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所(原上海原子能研究所)產(chǎn)品。

2.方 法

2.1 體外乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)

取出生2天的乳鼠,用75%乙醇消毒皮膚,固定乳鼠的頭及四肢,用75%乙醇消毒皮膚,剪開(kāi)胸部皮膚,再消毒一次,并更換手術(shù)器械,開(kāi)胸,彎鑷提取心臟,無(wú)菌條件下,將心臟放入盛有 DHanks溶液的平皿中,剪去心房,剪取心尖部分心室組織,D-Hanks液沖洗3次后,剪成約1mm3大小的碎塊,加入0.08%的膠原酶分次消化細(xì)胞,直至組織消化為半透明狀,采用含5%小牛血清的培養(yǎng)基中止消化,將消化好的細(xì)胞于離心管中800-1000轉(zhuǎn)∕分鐘離心10min,消化完畢后的細(xì)胞加入含20%小牛血清的高糖DME培養(yǎng)基,吹打均勻后以1×108/L的密度接種于6孔培養(yǎng)板,放入含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)的最初48h內(nèi),用含0.1mmol∕L Brdu培養(yǎng)基以抑制心肌細(xì)胞以外的細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.2 分組及干預(yù)

常規(guī)培養(yǎng)心肌細(xì)胞72h,細(xì)胞開(kāi)始連接成片,并出現(xiàn)同步搏動(dòng)。為觀察波動(dòng)性糖對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響,待細(xì)胞搏動(dòng)良好,將其隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、高糖組和波動(dòng)性糖組,每組8孔。對(duì)照組給予穩(wěn)定糖濃度(5.5mmol/L)、高糖組給予穩(wěn)定高糖濃度(25.5mmol/L),波動(dòng)性糖組給予波動(dòng)性糖濃度(5.5mmol/L和25.5mmol/L,每12h交替)的培養(yǎng)環(huán)境,其他培養(yǎng)條件保持一致。培養(yǎng)3d后,進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 心肌細(xì)胞肥大的檢測(cè)

分別從心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量,心肌細(xì)胞體積和心肌細(xì)胞蛋白合成速率三個(gè)方面檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大。

2.3.1 心肌細(xì)胞總蛋白質(zhì)含量測(cè)定

吸去培養(yǎng)板各孔中的培養(yǎng)液,用PBS液快速?zèng)_洗3次后,每孔加入含有0.1%的SDS(十二烷基硫酸鈉)三去污細(xì)胞裂解液0.5ml溶解細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù),每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)∕L。用Bradford法檢測(cè)每孔細(xì)胞蛋白含量。

2.3.2 心肌細(xì)胞體積測(cè)量

細(xì)胞體積是通過(guò)測(cè)量細(xì)胞直徑獲得,用PBS液快速?zèng)_洗長(zhǎng)滿細(xì)胞的培養(yǎng)3次,每孔加25%胰蛋白酶 0.3ml,放入 37℃恒溫箱中 10min后再加入0.2ml含有5%小牛血清的培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞。在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察其中的細(xì)胞,幾乎均呈球形。采用計(jì)算機(jī)細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測(cè)量單個(gè)細(xì)胞的直徑,進(jìn)而計(jì)算出細(xì)胞的體積,每孔隨機(jī)選擇4個(gè)視野,每個(gè)視野測(cè)20個(gè)細(xì)胞。

2.3.3 心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率測(cè)定

將培養(yǎng)在6孔培養(yǎng)板上的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24h,于12 h時(shí)加入37KBq3H-leucine。另備一組無(wú)任何細(xì)胞的單純培養(yǎng)基組,同樣加入37KBq3H-leucine,與其它組一起培養(yǎng)24h。倒掉培養(yǎng)液,用冷PBS快速?zèng)_洗3次,0.125%胰酶消化,經(jīng)0.45μm微孔濾膜真空負(fù)壓抽濾,三氯乙酸和 PBS液沖洗,干燥濾膜,加閃爍液5ml,采用液閃儀測(cè)量3H-leucine的放射強(qiáng)度,從而進(jìn)行蛋白合成的分析,根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù),每孔的細(xì)胞數(shù)大致為1×105個(gè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每孔的cpm值計(jì)算(實(shí)驗(yàn)組最終cpm值均為減掉單純培養(yǎng)基組cpm值)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)

結(jié) 果

1.心 肌細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)24-48h后開(kāi)始連接成片(圖1)。

2.三 組心肌細(xì)胞總蛋白含量

各組細(xì)胞培養(yǎng)3天后,用Bradford法測(cè)定每孔細(xì)胞的吸光度(OD值),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算為蛋白含量(表1)。將上表中數(shù)據(jù),用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果表明,高糖組和波動(dòng)性糖組與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞蛋白含量分別增加了18.6%(P<0.05)和15.6%(P<0.05),表明單純高糖、波動(dòng)性糖均有增加心肌細(xì)胞總蛋白含量的作用。證實(shí)高糖具有誘導(dǎo)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞總蛋白含量增加的作用,波動(dòng)性高糖同樣也具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞總蛋白含量增加的作用,且作用強(qiáng)度與高糖組相仿。

3.三 組心肌細(xì)胞體積測(cè)量和蛋白合成速率

三組分別加入單純高糖、正常糖濃度和波動(dòng)性高糖3種處理后培養(yǎng)3d。在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察其細(xì)胞幾乎均呈球形(圖2)。測(cè)量各組細(xì)胞體積的結(jié)果如表2所示。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 ×400Fig.1 The general culture of cardiomyocytes×400

采用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),高糖組和波動(dòng)性糖組與對(duì)照組相比心肌細(xì)胞體積都有明顯增加(P<0.01)。其中高糖組與對(duì)照組相比細(xì)胞體積增加了42%,證明單純性高糖可有效促進(jìn)心肌細(xì)胞體積增大。波動(dòng)性糖組與對(duì)照組相比體積增大了38.8%,波動(dòng)性糖組與高糖組對(duì)比無(wú)顯著性差異。表明波動(dòng)性高糖具有與單純性高糖相似的促進(jìn)心肌細(xì)胞體積增大的作用。

圖2 三組心肌細(xì)胞形態(tài)呈球形×400Fig.2 The cardiomyocytes were round in shape×400

表1 各組心肌細(xì)胞OD值和總蛋白含量(S,n=4)Table 1 OD value and total protein content of three group cardiomyocyte(S,n=4)

將3H-leucine分別與上述三組處理后的心肌細(xì)胞共同培養(yǎng)24h。用液閃儀測(cè)量各孔細(xì)胞與3H-leucine的結(jié)合量,進(jìn)行蛋白合成的分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。高糖組與對(duì)照組相比增加了8.3%其差異具有顯著性(P<0.01),表明單純高糖培養(yǎng)下確有蛋白合成的增加。波動(dòng)性糖組與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.01)7.6%。證明波動(dòng)性糖同樣具有促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白合成的作用。波動(dòng)性糖組與高糖組相比兩者之間沒(méi)有顯著性差異,說(shuō)明波動(dòng)性糖與單純性高糖相比其促進(jìn)心肌細(xì)胞蛋白合成作用相似。

表2 各組心肌細(xì)胞體積及心肌細(xì)胞蛋白合成(S,n=4)Table 2 The size and protein syntheses of three group cardiomyocyte(S,n=4)

討 論

糖尿病是一種常見(jiàn)的慢性病,高血糖是糖尿病的標(biāo)志,也是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的主要因素。糖尿病高血糖包括慢性波動(dòng)性高血糖和慢性持續(xù)性高血糖,慢性波動(dòng)性高血糖是指慢性間歇性或陣發(fā)性高血糖狀態(tài),亦稱血糖漂移。正常人的血糖受到精密的調(diào)控,波動(dòng)幅度較小;2型糖尿病患者的血糖波動(dòng)明顯增加。即使 HbA1c水平相似的糖尿病患者,其血糖波動(dòng)的幅度也可能相差甚遠(yuǎn),糖波動(dòng)幅度增大是糖代謝紊亂加重的征象。造成糖尿病患者血糖波動(dòng)過(guò)大的主要原因有兩個(gè):未經(jīng)合理控制的餐后高血糖和治療不當(dāng)導(dǎo)致的低血糖。許多研究表明,血糖波動(dòng)參與了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展,且波動(dòng)性高血糖相對(duì)于持續(xù)性高血糖并發(fā)癥危害更嚴(yán)重。目前普遍認(rèn)為,波動(dòng)性高血糖相比持續(xù)性高血糖更容易引發(fā)氧化應(yīng)激,進(jìn)一步加劇糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。臨床研究也證實(shí),波動(dòng)性高血糖的可顯著增加2型糖尿病患者的微血管病變和心血管死亡危險(xiǎn)[1-5]。

糖尿病心肌病于1972年最早由Rubler[6]首先提出,他們發(fā)現(xiàn)在許多糖尿病患者中存在心功能減退的現(xiàn)象,但找不到通常能導(dǎo)致心功能不全的病因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),這種無(wú)明確病因的心肌病變實(shí)際上是糖尿病的一種特殊并發(fā)癥,是一種獨(dú)立的疾病。1974年 Hamby等首次將此并發(fā)癥命名為糖尿病心肌病[7]。糖尿病心肌病系由糖代謝紊亂引起的心肌細(xì)胞學(xué)改變和心功能減退。糖尿病心肌病是排除了高血壓、冠心病及其它已知疾病所致的心肌損傷而獨(dú)立存在的病理生理狀態(tài),表現(xiàn)為心肌肥大,心臟收縮和(或)舒張功能障礙。其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,實(shí)驗(yàn)研究表明多種代謝紊亂構(gòu)成了糖尿病心肌功能和結(jié)構(gòu)改變的基礎(chǔ),局部?jī)?nèi)分泌的變化均參與了發(fā)病過(guò)程。心肌細(xì)胞壞死在糖尿病心肌病的發(fā)生中有重要意義[8]。關(guān)于糖尿病心肌細(xì)胞壞死的發(fā)生機(jī)制,有學(xué)者認(rèn)為糖尿病時(shí)高血糖能直接引起心肌細(xì)胞壞死[9]。也有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[10]。近年來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在糖尿病心肌病的發(fā)生中起作很重要的作用[11]。在糖尿病心肌病的發(fā)病過(guò)程中,單純性高糖可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的肥大,但波動(dòng)性高糖與心肌細(xì)胞肥大之間的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)主要從波動(dòng)性糖對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞總蛋白含量、細(xì)胞體積、蛋白合成三個(gè)方面的影響來(lái)探討波動(dòng)性高糖對(duì)心肌細(xì)胞肥大的影響,并與單純性高糖相比較。研究結(jié)果表明:波動(dòng)性糖可以增加心肌細(xì)胞總蛋白含量,顯著增加心肌細(xì)胞的體積,并可以增加心肌細(xì)胞的蛋白合成速率,且其作用程度與單純性高糖相似。通過(guò)上述結(jié)果我們認(rèn)為波動(dòng)性糖與單純性高糖一樣,具有促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的作用。從而,對(duì)于糖尿病心肌病的發(fā)展均具有促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)研究從波動(dòng)性糖促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大的角度,佐證了穩(wěn)定降糖治療的重要性,提示在糖尿病患者降糖治療過(guò)程中,特別是對(duì)于合并有心血管疾病的患者,以及懷疑有糖尿病心肌病變的患者,應(yīng)該關(guān)注患者的血糖波動(dòng),而不僅僅是滿足于患者是否脫離了持續(xù)性高糖狀態(tài)。血糖的波動(dòng)可能仍然不能改善糖尿病心肌病患者心肌肥大的進(jìn)展?，F(xiàn)代血糖控制的目標(biāo)應(yīng)該是降低高血糖、防止低血糖,減輕血糖波動(dòng)。以延緩糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展。對(duì)于糖尿病患者血糖的波動(dòng)越來(lái)越受到人們的關(guān)注,穩(wěn)定降糖已成為目前降糖治療的關(guān)鍵。

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