熒光碳納米粒子的制備及其在細胞標記中的應用*

韓文英，常云珍，高 飛

（山西大學 分子科學研究所 化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

自從Iijima發(fā)現(xiàn)碳納米管[1]以來，納米科技獲得了飛速發(fā)展。以碳為基礎的納米材料，包括碳納米管、納米金剛石、富勒烯、納米碳纖維和碳量子點等，在納米技術、生物傳感、生物標記以及作為藥物載體等方面都有著潛在的應用價值[2-4]。碳納米粒子（Carbon Nanoparticles,CNPs）作為一種新的碳納米材料，也引起了人們的極大關注[5-8]。Sun等人曾用激光消蝕法[9]獲得了多種尺寸的碳納米顆粒，經(jīng)表面鈍化處理，使碳納米顆粒發(fā)出了較強的可見光并用于生物標記。Zhou等人[10]以碳納米管為原料，用電化學方法制備了粒徑約為3 nm的碳納米顆粒。但與碳納米管、納米金剛石和傳統(tǒng)量子點的研究相比，熒光碳納米粒子由于其制備方法和分離技術匱乏，迄今尚無較充分的研究，相關報道也較少。

在生物醫(yī)學領域，常用傳統(tǒng)有機熒光染料對細胞、生物分子進行染色或修飾標記。但傳統(tǒng)有機熒光染料具有熒光壽命短、容易光解和褪色，且光解產(chǎn)物大多有毒有害，難以進行多色同時標記，生物相容性差等不足，使它們的應用受到限制。新型熒光標記試劑如復合型納米粒子、量子點、金屬納米粒子標記物，克服了傳統(tǒng)有機熒光染料的缺點，在生物和醫(yī)學領域中得到廣泛的應用[11-14]。熒光碳納米粒子（CNPs）作為一種新的量子點，與傳統(tǒng)有機染料相比具有明顯的優(yōu)越性：其水溶性好；毒性小；熒光強度高且穩(wěn)定性好，可經(jīng)受多次激發(fā)而不發(fā)生熒光淬滅，有利于研究細胞中生物分子間長期相互作用；不同粒徑大小的碳納米粒子具有不同的顏色，激發(fā)波長范圍寬且連續(xù)分布，可用同一波長的光激發(fā)獲得多種標記顏色；發(fā)射熒光譜峰窄且對稱，不出現(xiàn)交疊，使生物分子的多組分檢測變得容易。因而，CNPs是一種理想的新型熒光標記試劑。

本文制備了能夠發(fā)熒光的碳納米粒子并將其作為熒光標記物，對Hela細胞進行熒光標記，24 h后細胞仍然保持著很亮的熒光，顯示出熒光碳納米粒子很好的熒光穩(wěn)定性。鑒于熒光碳納米粒子具有上述諸多優(yōu)點，可望應用于生物分子和細胞的染色、標記、檢測等過程，在生物和醫(yī)藥領域具有重要的應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

雙波長紫外線分析儀；RE-52A旋轉蒸發(fā)器；美國PE LS-50B熒光光譜儀；IX 71熒光顯微鏡；FV1000激光共聚焦熒光顯微鏡；HF 160W水浴式CO2培養(yǎng)箱；DZKW-4電子恒溫水浴鍋；PHS-3C型酸度計。

蠟燭；30%H2O2；HAC；乙醚；胎牛血清（杭州四季青公司）；DMEM培養(yǎng)基；胰酶；多聚甲醛；人宮頸癌Hela細胞（本實驗室傳代保存培養(yǎng)）。

自配溶液：PBS平衡液；0.25%胰酶溶液（含10%胎牛血清的DMEM溶液）；MTT溶液；4%多聚甲醛溶液。

1.2 蠟燭煙灰的制備

首先將普通蠟燭燜燒，即將燃燒的蠟燭安放于倒置的坩堝中。蠟燭燜燒會產(chǎn)生濃煙，后者在倒置坩堝中形成煙炱，便于收集。在進行后續(xù)反應前，將煙炱用研缽磨細。

1.3 熒光碳納米粒子CNPS的制備

稱取0.5 g研細的煙炱置于250mL圓底燒瓶中，加入30%H2O270mL和35mL HAc[15]，用超聲波處理使其混合均勻，然后在恒溫磁力攪拌器上加熱回流。精細控制溫度使體系緩慢升溫，待液體微沸出現(xiàn)回流液滴時停止升溫?；亓鞒掷m(xù)一晝夜，體系變成黑色懸浮液。反應液冷卻至室溫并過濾，濾液為棕黃色。在紫外燈下可觀察到明顯的熒光。在熒光光譜儀上測定不同激發(fā)波長下濾液的熒光強度。將濾液旋轉蒸發(fā)至5～8mL，過濾。濾液用乙醚洗滌萃?。?×15 mL），將萃取物旋轉蒸發(fā)，真空干燥后得到較純的產(chǎn)品CNPS。

1.4 Hela細胞最佳接種密度選擇實驗

選取對數(shù)生長期Hela細胞，用0.25%胰蛋白酶消化處理，離心收集細胞，制備成細胞懸浮液。將細胞接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加200μL細胞懸液，調(diào)節(jié)細胞密度分別為 5.0×103、1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104和 3.5×104個·mL-1，每孔細胞數(shù)分別為 1000、2000、3000、4000、5000、6000和7000個·孔-1。設空白調(diào)零孔（只加培養(yǎng)液，不加細胞），每組設6個平行孔，重復兩次，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。實驗終止前4 h每孔加入 20 μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。用移液槍小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，低速振蕩10min，使MTT深藍色結晶物溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在490nm波長下各孔的吸光度（A值），記錄實驗結果。繪制吸光度與細胞密度曲線，確定后續(xù)實驗的最佳細胞接種密度。細胞吸光度值應在0～0.7范圍內(nèi)。

1.5 MTT比色法測定不同濃度CNPs對Hela細胞活性的影響

選取對數(shù)生長期Hela細胞，消化，離心收集細胞，制備成細胞懸浮液。計數(shù)調(diào)整細胞密度為2.0×104個·mL-1，接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加200μL細胞懸液，細胞數(shù)約為4000個·孔-1。另外設一個空白組（只加200μL培養(yǎng)液，不加細胞）。每組設6個平行孔，重復兩次，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h細胞貼壁后，吸去上清液，加入新的培養(yǎng)液，同時加入不同濃度的CNPs溶液，使其成為終濃度為0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550和 600μg·mL-1的 CNPs培養(yǎng)液，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。實驗終止前4h每孔加入20μL MTT溶液（5 mg·mL-1），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩 10 min，使深藍色沉淀物充分溶解，用酶標儀測定各孔在490 nm波長下的吸光度（A值），記錄結果。按照下列公式計算細胞生長活力：細胞活力（%）=（加藥組A值平均值/對照組A值平均值）×100%。

1.6 用CNPS標記Hela細胞

選取對數(shù)生長期Hela細胞，消化，離心收集細胞，制備成細胞懸浮液。將細胞接種于放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，細胞密度以5×104個·mL-1為宜，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。20 h細胞貼壁后，吸去上清液，加入濃度為 0、50、100、150μg·mL-1的CNPs培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)液，用1 mL PBS平衡液洗3次，每次浸泡1min。然后加入500μL4%多聚甲醛溶液，室溫下固定8min，吸去多聚甲醛溶液，再用1mL PBS平衡液浸泡3次，浸泡時間依次為2、2、5min。向載玻片上滴一滴0.9%的甘油，將蓋玻片挑出，晾干后放置于甘油上，注意須使蓋玻片上長有細胞的一面朝向甘油放置，用指甲油封口，晾干，保存于4℃冰箱中。在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察CNPs對細胞的標記情況。

2 結果與討論

2.1 熒光碳納米粒子的發(fā)光特性

蠟燭煙炱經(jīng) 30%H2O2/ACOH（V/V=2∶1）混合液回流一晝夜后得到黑色懸浮液，過濾后濾液呈棕黃色。在紫外燈下可觀察到明顯的熒光。圖1為回流液過濾后濾液的熒光光譜圖。

圖1 不同激發(fā)波長下CNPS的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of CNPS with different excitation wavelength

圖1中6條譜線分別對應于不同的激發(fā)波長。由圖1可知，熒光發(fā)射峰峰形對稱、半峰寬較窄、具有較強的熒光。隨著激發(fā)波長的增加，熒光強度是先增加后降低,最佳激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長在445nm左右。

圖2是不同pH值下CNPS的熒光光譜圖。

圖2 不同pH值下CNPS的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of CNPS in different pH value

將CNPS用三蒸水溶解配制成一定濃度的CNPS溶液，在不同pH值下測定其熒光強度。7條譜線分別對應于不同的pH值。由圖2可知，隨著pH值增大，CNPS溶液的熒光強度表現(xiàn)為先增后減，并且在pH值為7.0附近時溶液的熒光強度最大。此結果對于CNPS能夠作為熒光標記物應用于細胞和生物醫(yī)學領域具有重要價值。

在制備熒光碳納米粒子過程中，用氧化劑回流蠟燭煙炱，其作用可能是破壞了碳納米粒子間的相互作用，使之有利于形成較為分散的納米晶粒，同時在粒子表面引入-OH、-COOH或其它氧化基團,使其帶負電性和具有親水性。氧化劑處理后得到的碳納米粒子與原蠟燭煙炱的化學成分有所不同，氧化后的CNPS中氧含量明顯增高，有羰基出現(xiàn)，這些結果得到紅外光譜的支持。

圖3為CNPs的紅外光譜圖。

圖3 CNPs的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of CNPs

圖3中數(shù)字顯示的是吸收峰的波長，在1735cm-1處有一強吸收峰。而大部分的羰基化合物是在1650～1900 cm-1，且羰基峰都尖銳或稍寬，其強度都較大，所以圖中1735cm-1處應該是羰基峰。利用氧化劑處理碳納米材料的方法業(yè)已廣泛用于碳納米管的表面修飾和功能化[9]。我們在實驗中選用了H2O2作為氧化劑，其反應產(chǎn)物為水，屬于綠色型試劑，對環(huán)境無污染，是理想的氧化劑。

2.2 Hela細胞最佳接種密度選擇結果

為了得到Hela細胞在后續(xù)實驗中的最佳密度，我們首先通過細胞密度篩選實驗來確定實驗最佳接種密度。MTT法得出細胞密度分別為5.0×103、1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104和 3.5×104個·mL-1時Hela細胞在490 nm處的吸光度值。從吸光度與細胞密度曲線圖中可以看出，Hela細胞密度為2.0×104個·mL-1時處于曲線線性部位，且吸光度在0～0.7之間（如圖4所示），故選取細胞的接種密度為2.0×104個·mL-1，后續(xù)實驗中均采用此密度值。

圖4 Hela細胞接種密度與吸光度關系Fig.4 The relationship of Hela cells density of inoculation and OD value

2.3 不同濃度CNPs對Hela細胞活性的影響

為了研究CNPs對Hela細胞生長活性的影響，我們首先選擇MTT法來檢測CNPs對Hela細胞的細胞毒性作用。利用不同濃度的CNPs培養(yǎng)液孵育細胞48h，用酶標儀測定各孔在490 nm波長下的吸光度A值，實驗結果見圖5。

圖5 不同濃度CNPs溶液作用Hela細胞48h后對應的細胞相對活力圖Fig.5 The relative cell viability of Hela cells that incubated with different concentrations of CNPs solution after 48h

結果表明，不同濃度CNPs溶液處理Hela細胞48h后，細胞代謝MTT的能力增加，說明CNPs對Hela細胞具有明顯的促進作用，并且細胞生長率隨CNPs濃度的升高而增高，CNPs對Hela細胞沒有毒性作用，而且CNPs能夠促進Hela細胞的生長。

2.4 激光共聚焦熒光顯微鏡成像圖像分析

圖6為不同濃度CNPS溶液對HeLa細胞進行熒光標記。

圖6 不同濃度CNPs溶液對HeLa細胞熒光標記圖像Fig.6 The fluorescent labeling images of Hela cells with different concentrations of CNPS

作用4h后固定細胞的激光共聚焦熒光顯微鏡成像照片。圖a～d分別對應質(zhì)量濃度為0、50、100、150μg·mL-1的CNPS溶液作用于HeLa細胞4h后在高倍鏡下的成像照片。圖e是質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的CNPS溶液作用HeLa細胞4h后在低倍鏡下的成像照片。圖b～e中HeLa細胞在488nm的藍光激發(fā)下呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光圖片，表明可以通過熒光碳納米粒子實現(xiàn)對HeLa固定細胞的直接染色標記。標記的固定細胞在4℃冰箱中放置24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察，細胞仍然保持著很亮的熒光，表明熒光碳納米粒子具有很好的熒光穩(wěn)定性。

3 結論

本文用氧化劑回流蠟燭煙炱，制備了熒光碳納米粒子，并用不同濃度的熒光碳納米粒子對Hela細胞進行了熒光標記，結果表明熒光碳納米粒子能很好地對細胞進行長時間熒光標記，具有較強的熒光穩(wěn)定性。熒光碳納米粒子具有無毒、化學惰性和良好的生物相容性等優(yōu)點，且可進行多色標記，發(fā)光強度高，光化學穩(wěn)定性好，它有望替代傳統(tǒng)的有機熒光染料，實現(xiàn)對細胞、生物分子的染色或修飾標記，進行高靈敏度和高通量細胞和分子鑒別、測量分析等的研究。

目前，熒光碳納米粒子的研究尚屬初級階段，對氧化回流獲得的CNPs發(fā)光機理也有待研究?？梢哉f，這一領域是一片尚未充分探索的蠻荒地帶，存在諸多問題有待解決。例如，不同氧化劑能否改變粒子的熒光性質(zhì)？初始蠟燭煙炱的微觀結構對碳納米粒子的發(fā)光性質(zhì)有何影響？如何進一步提高CNPs的發(fā)光效率？雖然這一新材料僅僅初顯崢嶸，但其不同凡響的特性昭示著它會在許多領域獲得應用。我們相信，這一領域必將涌現(xiàn)出更多新的、令人神往的發(fā)現(xiàn)和燦爛的前景。

［1］Iijima S.Helical microtubules ofgraphitic carbon［J］.Nature,1991,354:56-58.

［2］Kam N W S,Liu Z,Dai H J.Functionalization of carbon nanotubes via cleavable disulde bonds for efcient intracellular delivery of si-RNAand potent gene silencing［J］.J.Am.Chem.Soc.，2005,127（36）：12492-12493.

［3］Fu C C,Lee H Y,Chen K,et al.Characterization and application of single fluorescent nanodiamonds as cellular biomarkers［J］.PNAS,January，2007，16：727-732.

［4］Li Z H,Wang K,Tan W H,et al.Preparation of luminescent CdTe quantum dots doped core-shell nanoparticle sand their application in cell recognition［J］.Chinese Science Bulletin,2005，50（13）:1318-1322.

［5］姚延立,馬國利,伊厚會,王曉敏.制備粒徑均勻碳納米顆粒的研究［J］.濱州學院學報,2009,25（3）:54-57.

［6］張陽德,張彥瓊,陳記稷，等.殼聚糖-碳納米粒的制備及其體外性質(zhì)的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2006,16（6）:13-18.

［7］張陽德,肖志剛,張浩偉，等.載藥納米粒在肝癌靶向治療中的研究進展［J］.中國醫(yī)學工程,2005,13（6）:609-613.

［8］謝華清.殼狀碳納米顆粒的制備和分散［J］.新型碳材料,2007,22（1）:80-83.

［9］Sun YP,Zhou B,Lin Yet al.Quantum-sized carbon dots for bright and colourful photoluminescence［J］.J.Am.Chem.Soc.,2006,128:7756-7757.

［10］Zhou J,Booker C.,Li R.et al.An electrochemical avenue to blue luminescent nanocrystals from multiwalled carbon nanotubes（MWCNTs）［J］.J.Am.Chem.Soc.,2007,29（1）:744-745.

［11］Bmchez MJ,Moronne M,Gin P,et al.Semiconductor nanocrystals as f1uorescent biological labels［J］.Science（S0036-8075）,1998,281:2013-201.

［12］Han M Y,Gao X H,Su J Z,Nie S M.Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical codingofbiomolecules［J］.Nature Biotechnology,2001,19（7）：631-635.

［13］James A.J.Fitzpatrick,Susan K.Andreko,Lauren A.Ernst,et al.Long-term persistence and spectral blue shifting of quantum dots in vivo［J］.NanoLetters,2009,（9）：2736-2741.

［14］Cao L,Wang X,Sun Y Pet al.Carbon dots for multiphoton bioimaging［J］.J.Am.Chem.Soc.,2007,129：11318-11319.

［15］Liu H,Ye T,Mao C.Fluorescent carbon nanoparticles derived fromcandlesoot［J］.Angew.Chem.Int.Ed.，2007,46：6473-6475.