聚乙二醇修飾物混合曲拉通X100-硫酸鹽-液-固萃取體系分離純化基因重組蛋白的可行性研究

沈靜茹，韋 康，余學(xué)紅，茶永軍

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院分析化學(xué)國家民委重點實驗室，武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074)

綠色熒光蛋白(GFP)是由238個氨基酸殘基組成的單鏈.基于其具有易于檢測［1］、熒光穩(wěn)定、無毒害、易于構(gòu)建載體等優(yōu)點［2］，作為備受青睞的標(biāo)記分子，GFP得以廣泛應(yīng)用.目前分離純化基因重組蛋白和多肽常用技術(shù)為層析.YuChen［3］等用陰離子交換層析濃縮純化α-胎蛋白，純度達(dá)到95%;Ceccaroli P［4］等采用疏水作用色譜成功分離出了具有生物活性的己糖激酶，所用柱型為Phenyl-Sepharose，回收率達(dá)到90%.Sohel Dalal［5］等用Ni2+螯合金屬層析法純化在大腸桿菌中過度表達(dá)的綠色熒光基因重組融合蛋白，回收率達(dá)到91%.雖純度較理想，但步驟繁瑣、耗時、目標(biāo)蛋白所得量有限等也是層析法局限性所在.液-固萃取體系分相操作無需特殊技術(shù)處理，費用低廉，且成相聚合物及鹽對生物活性物質(zhì)有穩(wěn)定和保護作用，能應(yīng)用于萃取酶、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)［6，7］.本文采用聚乙二醇天冬氨酸修飾物［PEG6000-ASP-Cu(Ⅱ)］混合曲拉通X-100-硫酸鹽-水液-固體系分離純化含綠色熒光蛋白的基因重組蛋白，利用修飾物PEG6000-ASP-Cu(Ⅱ)增強萃取體系對目標(biāo)蛋白的選擇性，探究了該融合蛋白在體系中最適用的熒光檢測方法，并得到一次正萃固相收得率達(dá)100%和一次反萃取率達(dá)68%的結(jié)果.

1 主要試劑與儀器

1.1 試劑

天門冬氨酸(國藥集團化學(xué)試劑公司);蛋白胨及酵母浸粉(北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠);異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，sigma公司);氨芐青霉素(Amp，Amresco分裝);聚乙二醇天冬氨酸修飾物(自制);蛋白質(zhì)溶液(取自工程菌培養(yǎng));超純水;其他試劑均為分析純.

1.2 儀器

78-1型磁力加熱攪拌器(杭州儀表電機廠);NEXUS 470型智能傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司);手提式不銹鋼蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司);TOMY AutoCLAVE SS-325自動蒸汽消毒柜(日本);高速冷凍離心機(CR22G型，日立公司);HQL150C恒溫?fù)u床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司);新苗凈化工作臺(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);MSE Soniprep150超聲波細(xì)胞破碎儀;101-A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司);LS-55型熒光/磷光/發(fā)光光度計(PE公司).

1.3 聚乙二醇天冬氨酸修飾物的合成及菌液培養(yǎng)

1.3.1 修飾物的合成

聚乙二醇6000酰氯化，得氯化聚乙二醇;將氯化聚乙二醇與L-天門冬氨酸反應(yīng)，將氨基酸引入PEG中;將已引入氨基酸的產(chǎn)物加至含過量硫酸銅的水溶液中，攪拌24 h，得最終產(chǎn)物 PEG-Asp-Cu(Ⅱ)［8］.反應(yīng)過程見圖 1.

圖1 PEG-Asp-Cu(Ⅱ)反應(yīng)歷程Fig.1 Mechanism reaction of PEG-Asp-Cu(Ⅱ)

1.3.2 含融合蛋白的菌原液培養(yǎng)

稱取適量酵母浸粉、蛋白胨、氯化鈉溶于蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0制成LB培養(yǎng)基，分裝至小試管與錐形瓶中，密封，高溫高壓滅菌，烘干備用.取PQE-31-GFP單菌落接種至含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振搖過夜，從活化過夜的菌液中吸取少量轉(zhuǎn)接至含Amp的LB培養(yǎng)基，置于37℃恒溫?fù)u床擴大培養(yǎng)，至菌液OD600達(dá)到0.6～0.8，加入IPTG誘導(dǎo)，振搖培養(yǎng)4 h.高速離心除去培養(yǎng)基，蒸餾水懸浮菌體，超聲波破碎，高速離心，取上清液，即為所需菌原液［9］.

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG6000-ASP-Cu(Ⅱ)修飾物的表征

圖2為聚乙二醇修飾物及其合成成分的紫外可見吸收譜圖.由圖2可知，PEG6000、Asp、Cu2+混合物紫外吸收光譜圖(曲線a)與Asp、Cu2+混合物的紫外吸收譜圖(曲線b)相似，而與修飾物的紫外吸收光譜圖(曲線c)不同，由曲線c可知，有新的吸收峰產(chǎn)生，說明有不同于混合物成分的其他物質(zhì)生成.

圖2 聚乙二醇修飾物及其合成成分的紫外可見吸收譜圖Fig.2 UV spectra of the synthetic raw material and modification

圖3為聚乙二醇(曲線a)及其修飾物(曲線b)紅外譜圖.由圖3知，曲線 b在3430 cm－1處的υ－OH吸收峰透過率較曲線a增大，即吸收峰減弱明顯，說明羥基數(shù)目減少，證實了PEG的羥基被取代，形成最終產(chǎn)物PEG6000-ASP-Cu(Ⅱ).

圖3 聚乙二醇及修飾物IR譜圖Fig.3 IR spectra of polyethylene glycol and modification

2.2 萃取體系中表征目標(biāo)蛋白熒光方法的選擇

2.2.1 目標(biāo)蛋白最佳熒光激發(fā)、發(fā)射波長的探究

將菌蛋白原液稀釋250倍，進(jìn)行熒光掃描，預(yù)掃描確定激發(fā)光譜及發(fā)射光譜的光譜范圍，記錄最佳激發(fā)及發(fā)射波長.得到目標(biāo)蛋白激發(fā)及發(fā)射光譜(見圖4).由圖4可知，目標(biāo)蛋白最佳測定條件為:最佳激發(fā)波長220 nm，最佳發(fā)射波長334 nm，激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度均為12.5 nm.

2.2.2 液-固萃取體系各因素對目標(biāo)蛋白熒光光譜的影響

配制濃度為1.6 mol/L的硫酸銨溶液，體積分?jǐn)?shù)為12.8%的曲拉通X-100溶液，質(zhì)量濃度為0.8 g/mL PEG-ASP-Cu(Ⅱ)溶液，稀釋250倍的目標(biāo)蛋

圖4 融合蛋白液的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of the recombinant fusion protein

白溶液.在固定激發(fā)波長為220 nm，調(diào)節(jié)激發(fā)波長及發(fā)射波長的狹縫寬度均為12.5 nm，掃描上述溶液的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見圖5.此熒光條件下，目標(biāo)蛋白在最佳吸收波長334 nm處，硫酸銨溶液以及聚乙二醇修飾物溶液無熒光響應(yīng)，而12.8% 曲拉通X-100溶液則有很強的熒光吸收.實際萃取體系中，曲拉通X-100體積分?jǐn)?shù)約定為12.8%，因此，選用曲拉通X-100、硫酸銨液固萃取體系分離純化目標(biāo)蛋白時，采用常規(guī)熒光法檢測目標(biāo)蛋白將受到曲拉通X-100溶液的干擾.

圖5 硫酸銨、曲拉通X-100、PEG6000-ASP-Cu(Ⅱ)修飾物及目標(biāo)蛋白液的熒光發(fā)射譜圖Fig.5 Em spectra ofmodifier，ammonium sulfate，Triton X-100 and protein

2.2.3 恒波長同步熒光法在液-固萃取體系中測定目標(biāo)蛋白的可行性研究

對目標(biāo)蛋白進(jìn)行恒波長同步熒光掃描，變換波長差值(10～150 nm)，調(diào)整合適的激發(fā)波長及發(fā)射波長的狹縫寬度，確定恒波長同步熒光法測定目標(biāo)蛋白質(zhì)的最佳條件為:波長差20 nm，激發(fā)波長狹縫寬度10 nm，發(fā)射波長狹縫寬度15 nm.按上述條件，對含有綠色熒光蛋白的菌(PQE-31-GFP)蛋白液以及提取于對照菌(pGEM)中的蛋白液進(jìn)行恒波長同步熒光掃描，結(jié)果見圖6.對萃取體系中各因素及目標(biāo)蛋白溶液進(jìn)行恒波長同步熒光掃描，結(jié)果見圖7.

圖6 2種融合蛋白恒波長同步熒光掃描圖Fig.6 Constant-wavelength synchronous fluorescence spectra of two kinds of protein

由圖6可知，曲線a，目標(biāo)蛋白的熒光光譜在287.50、487.19 nm 各有一個譜峰，曲線 b為提取于對照菌中的蛋白質(zhì)，僅在287.50 nm有譜峰，在487.19 nm無熒光響應(yīng)峰，因此可確定487.19 nm的峰為含綠色熒光蛋白的目標(biāo)蛋白特征光譜峰.由圖7可知，采用恒波長同步熒光法測定目標(biāo)蛋白，在目標(biāo)蛋白的特征吸收峰487.19 nm處，萃取體系中PEG-ASP-Cu(Ⅱ)修飾物和硫酸銨的熒光響應(yīng)值均較小，曲拉通X-100雖有響應(yīng)，但對目標(biāo)蛋白的測定影響也較小.因此，選用恒波長同步熒光法測定PEG-ASP-Cu(Ⅱ)混合曲拉通X-100-硫酸銨液-固萃取體系中含綠色熒光蛋白的目標(biāo)蛋白是可行的.

圖7 體系中各成分的恒波長同步熒光光譜掃描圖Fig.7 Constant-wavelength synchronous fluorescence spectra of all part of System

2.3 萃取條件實驗

2.3.1 萃取方法

依次取硫酸銨儲備液，曲拉通X-100儲備液，PEG-ASP-Cu(Ⅱ)修飾物溶液以及等量目標(biāo)蛋白溶液于25 mL比色管中，加水定容至10 mL并于振蕩器上振蕩15 min，之后冰水浴靜置20 min.體系分為固、液兩相.將液相(鹽水相)傾至另一比色管中，用超純水定容至25 mL，固相溶解后定容至25 mL.采用上述最佳恒波長同步熒光法分別掃描定容完畢的固、液兩相，讀取487.19 nm處熒光強度值并計算固相收得率.

2.3.2 正萃取條件實驗

探究了未加修飾物與加入修飾物后萃取體系對目標(biāo)蛋白收得率的影響(見圖8和圖9).由圖8可知，未加入修飾物(聚合物曲拉通X-100濃度由0.08 mL/mL增至0.14 mL/mL)的單純萃取體系，對目標(biāo)蛋白的萃取率為50% ～89%;圖9中加入修飾物PEG-ASP-Cu(Ⅱ)(濃度由0.7 g/mL增至1.1 g/mL)的萃取體系，可將收得率提升并穩(wěn)定至97%以上，最高可達(dá)100%.

圖8 未加入修飾物萃取體系中兩相配比變化對萃取率的影響Fig.8 Influence of extraction ratio by change the two phase ratio ofwithoutmodifications in extraction system

圖9 萃取體系中加入修飾物的量對目標(biāo)蛋白質(zhì)萃取率的影響Fig.9 Influence of extraction ratio by change the Amount of join modifications in extraction system

2.3.3 反萃取條件實驗

于正萃后的固相中，加入一定濃度的EDTA溶液及硫酸銨溶液，反萃目標(biāo)蛋白.同樣采用恒波長同步熒光法，讀取487.19 nm處熒光強度值并計算液相收得率即為反萃取率.探究了酸度(pH 5.0～8.0)對反萃取率的影響(見圖10).由圖10可知，通過改變酸度優(yōu)化反萃條件，最高反萃取率可達(dá)68%.

圖10 酸度對反萃取率的影響Fig.10 Influence of pH for reversed extraction ratio

3 結(jié)語

以工程菌中被綠色熒光蛋白修飾的基因重組融合蛋白為對象，構(gòu)建了聚乙二醇天冬氨酸修飾物PEG-ASP-Cu(Ⅱ)混合曲拉通 X-100-硫酸鹽-水液-固萃取體系純化該蛋白.探討了在體系中適用的表征目標(biāo)蛋白的熒光方法，通過實驗確定了采用恒波長同步熒光法測定目標(biāo)蛋白質(zhì)，可排除萃取體系中其他因素如曲拉通 X-100、硫酸銨、PEG-ASP-Cu(Ⅱ)修飾物等對目標(biāo)蛋白的測定影響，得出最佳測定條件:波長差Δλ=20 nm，發(fā)射狹縫寬度ExSlit=10.0 nm，激發(fā)狹縫寬度 EmSlit=15.0 nm.通過驗證可知該萃取體系對目標(biāo)蛋白正萃分離條件及反萃條件.實驗證明:未加入修飾物的單純萃取體系對目標(biāo)蛋白一次萃取固相收得率最高可達(dá)89%;加入修飾物后，體系對目標(biāo)蛋白的一次萃取固相收得率可提升并穩(wěn)定至97%以上，最高可達(dá)100%，一次反萃取率達(dá)68%，該萃取體系應(yīng)能實現(xiàn)分離純化目標(biāo)基因重組蛋白的目的.

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