荊門地區(qū)長壽老人血漿FFA亞組分及血脂分析

左 玲，寧樂平

(1.湖北省荊門市第一人民醫(yī)院，湖北荊門448000;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢430071)

鐘祥市是中國六大長壽地區(qū)之一，據(jù)第五次人口普查資料顯示，鐘祥市人均壽命為75.88歲，高于中國平均水平4.48歲，比世界平均水平高9.88歲。世界衛(wèi)生組織［1］認(rèn)為，人的壽命與四大因素有關(guān)，一是遺傳，占15%;二是社會環(huán)境與自然環(huán)境，占17%;三是醫(yī)療衛(wèi)生水平，占8%;四是生活方式與生活習(xí)慣，占60%。早前的研究表明［2］，人體內(nèi)血漿總膽固醇(cholesterol，TC)、三酰甘油(triacylglycerol，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low densitylipoprotein cholestorol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholestorol，HDL-C)和游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)，特別是FFA的亞組分，與長壽有密切的聯(lián)系。多不飽和脂肪酸的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)的脂肪酸，根據(jù)第一個不飽和鍵位置不同可分n-6、n-3兩大類［3］。本實驗中收集湖北鐘祥長壽村老人的血漿，檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指標(biāo)，并用高效液相色譜(HPLC)法分析其血漿FFA亞組分，探討長壽村老人血漿FFA亞組分。

1 對象與方法

1.1 研究對象 長壽村組樣本均來自荊門地區(qū)鐘祥鄉(xiāng)鎮(zhèn)居住的長壽村老人。樣本選擇標(biāo)準(zhǔn):女≥85歲，男≥75歲。包括男84例，平均年齡(83.47±16.87)歲，女 38 例，平均年齡(88.31 ±16.70)歲。正常對照組樣本均來自荊門地區(qū)非長壽村居住的市區(qū)居民老人。樣本選取標(biāo)準(zhǔn):女≤85歲，男≤75歲，共94例，其中男54例，女40例，平均年齡(80.08±10.02)歲，皆無糖尿病家族史，無肥胖、高血壓、冠心病、肝、腎和甲狀腺疾病。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器 Dionex Summit高效液相色譜儀，Dionex P680A低壓四元梯度泵，Dionex PDA-100紫外/可見二極管陣列檢測器，Dionex ASI-100自動進(jìn)樣器，Dionex TCC-100柱溫箱，Dionex變色龍數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)。

1.2.2 試劑 月桂酸(C12∶0)、豆蔻酸(C14∶0)、軟脂酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、軟油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)等標(biāo)準(zhǔn)品，以及溴苯乙酮、三乙胺均購自SIGMA公司。異丙醇、乙腈等購自上海國藥集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 體格檢查后采集空腹靜脈血5 mL，抗凝、離心、分離血漿，一部分用來檢測 TC、TG、LDL-C、HDL-C等血脂指標(biāo)，一部分 －80℃冰箱保存，以分析FFA。

1.3.2 血脂分析 用全自動生化測定儀測定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白 A 和血糖(blood sugar，GLU)水平。

1.3.3 FFA 萃取 根據(jù)文獻(xiàn)方法［4］，血漿解凍，取玻璃管一支，先后加入0.2 mL血漿、1 mL萃取液，加入 20 μL 100 mg/L C17∶0 作為內(nèi)標(biāo)，振蕩混勻，室溫下孵育10 min。加入0.4 mL正庚烷和0.6 mL水，充分振蕩混勻、離心，取400 μL上層有機相，小心轉(zhuǎn)移至玻璃試管內(nèi)。氮氣吹干、酯化。

1.3.4 FFA衍化 根據(jù)文獻(xiàn)方法［5］，氮氣吹干的血漿樣品或脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品中加入50 μL 20 g/L 2-溴苯乙酮和50 μL 25 g/L三乙胺的丙酮溶液，混勻。于90℃水浴、冷卻。再加入75 μL 10 g/L的醋酸丙酮溶液，混勻、離心。90℃水浴、冷卻。氮氣吹干后密封，用流動相重新溶解，混勻、離心去除顆粒，進(jìn)樣分析。先配置混合標(biāo)準(zhǔn)品(表1)。再用單個FFA標(biāo)準(zhǔn)品定性，確定每一個峰代表的FFA亞組分。上機條件為:柱溫37℃;檢測波長242 nm;流動相為甲醇∶乙腈∶水 =82∶9∶9，流速為1.0 mL/min。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 混合標(biāo)準(zhǔn)品中10種FFA的濃度

1.3.5 方法學(xué)評價

1.3.5.1 各種FFA亞組分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限 本實驗FFA標(biāo)準(zhǔn)曲線在分析范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2＞0.99)。日內(nèi)(n=6)相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)為0.9%～3.5%，日間(n=6)RSD為1.5%～ 4.4%，檢測限為 0.05 μmol/L(C20∶5)～0.35 μmol/L(C16∶0)，靈敏度足以檢測痕量的 FFA。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:根據(jù)預(yù)試驗中FFA所測的濃度，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度的覆蓋范圍。將9種單個游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品混合成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行連續(xù)6次倍比稀釋，每種濃度下取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液200 μL，加入 20 μL 100 mg/L C17∶0，氮氣吹干，后續(xù)步驟同實際樣本，每種濃度平行做3組。以各FFA峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為橫坐標(biāo)(X)，各FFA濃度為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸分析。

1.3.5.2 精密度及回收率測定 取人血漿標(biāo)本一份，加入高、中、低3種濃度(表1)的混合FFA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，3種濃度平行做8組，按前述步驟進(jìn)行色譜分析，計算樣品回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。將6個相同濃度的樣品，隨機插入同一天不同處理批次中，在1 d內(nèi)不同時間進(jìn)樣，計算日內(nèi)RSD;同一批次處理6個相同濃度樣品，置－20℃冰箱保存，連續(xù)6 d于相同時間進(jìn)樣，計算日間RSD。各種FFA亞組分高、中、低3種濃度回收率及精密度:高、中、低3種濃度(n=8)的回收率為 96.4%～104.8%，精密度為1.5%～4.9%，符合《生物材料分析方法的研制準(zhǔn)則》相關(guān)要求。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長壽組與正常對照組典型色譜圖 兩組標(biāo)本中FFA所測亞組分的典型色譜圖(圖1)所示，色譜圖橫坐標(biāo)為保留時間(min)，縱坐標(biāo)為毫吸光度單位(mAU)，其中包含10個吸收峰圖，每個峰代表一種FFA，在同一色譜條件下，每種FFA的保留時間(即出峰時間)是固定的。

圖1 長壽組與正常對照組典型色譜圖

2.2 兩組各檢測指標(biāo)比較 長壽組與正常對照組比較，GLU、TC、TG、HDL-C、TFA、不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)明顯升高(P ＜0.05)，LDL-C顯著降低(P＜0.01)，但均未超出正常值范圍。從亞組分來看，C12∶0、C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C20∶5 都顯著升高(P ＜0.05)，而 C18∶2 卻顯著降低(P ＜0.01)(表2)。

3 討論

湖北鐘祥長壽村是我國六大長壽村之一，一直受到很多學(xué)者的關(guān)注。從宏觀看，人的壽命與遺傳、社會環(huán)境與自然環(huán)境、醫(yī)療衛(wèi)生水平、生活方式與生活習(xí)慣等幾大因素相關(guān)。本實驗從TC、TG、LDL-C、HDL-C以及FFA的亞組分角度，探討其與鐘祥長壽的相關(guān)性。

實驗結(jié)果顯示，長壽組與非長壽村健康人群比較，GLU、TC、TG、TFA、UFA 等指標(biāo)都明顯升高，但均未超出正常值范圍。國內(nèi)相關(guān)篩查表明［6］，人體內(nèi)的血脂指標(biāo)隨著年齡而增長。FFA作為血脂成分之一，長壽組中FFA總濃度［7］，也明顯升高。從亞組分來看，C12∶0、C16∶0、C18∶0、C16∶1、C18∶1、C20∶5 都顯著升高，而C18∶2卻顯著降低。

表2 長壽村組與正常對照組血漿脂質(zhì)、糖及FFA亞組分對比分析(±s)

表2 長壽村組與正常對照組血漿脂質(zhì)、糖及FFA亞組分對比分析(±s)

注:血糖(GLU);總膽固醇(TC);三酰甘油(TG);高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C);低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C);不飽和脂肪酸濃度(UFA);總游離脂肪酸濃度(TFA)

組別 例數(shù) GLU(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)C12∶0(μmol/L)C14∶0(μmol/L)C16∶0(μmol/L)長壽組 122 5.75±1.71 4.67 ±0.87 1.26±0.76 1.43 ±0.30 2.03 ±0.52 5.00±0.60 14.37 ±8.47 125.48 ±77.25正常對照組 94 5.38±0.34 4.02 ±0.45 0.97±0.32 1.29 ±0.23 2.40 ±0.36 1.57±0.20 14.72 ±9.95 103.69 ±33.00 t 2.067 6.593 3.47 3.75 －5.89 77.25 －0.28 2.56 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05組別 例數(shù) C18∶0(μmol/L)C16∶1(μmol/L)C18∶1(μmol/L)C18∶2(μmol/L)C20∶4(μmol/L)C20∶5(μmol/L)UFA(μmol/L)TFA(μmol/L)長壽組 122 35.21 ±2.44 20.95 ±1.40 161.38 ±9.77 57.84 ±2.95 2.39 ±0.19 1.246 ±0.09 246.40 ±153.66424.42 ±248.06正常對照組 94 25.56±8.32 10.16 ±5.51 106.84±35.66 90.18 ±28.03 2.39 ±0.11 0.79±0.09 209.99 ±65.07 355.55 ±102.40 t 12.16 20.79 16.14 －12.66 0 36.92 2.15 2.53 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05

有研究表明［8］，游離脂肪酸能增強解耦聯(lián)蛋白的活性，從而減少活性氧的生成，延緩衰老。本研究結(jié)果顯示，長壽老人血漿中 C12∶0、C18∶0、C16∶1 等三種FFA較正常健康人群顯著升高。這些升高的飽和脂肪酸可能減少活性氧的生成，延緩了細(xì)胞的衰老。國外營養(yǎng)界的新觀點［9］認(rèn)為:油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，卻不降低有益膽固醇。本實驗結(jié)果顯示，長壽組中油酸的升高，降低了心血管等疾病的發(fā)病率，也是長壽的原因之一。

本實驗結(jié)果還顯示，長壽老人血漿C18∶2顯著降低，C20∶5顯著升高。人體內(nèi)多不飽和脂肪酸主要分為n-3族和n-6族脂肪酸，n-3多不飽和脂肪酸攝取量可以促進(jìn)嬰幼兒視網(wǎng)膜、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［10］;而 n-6 族脂肪酸［11］能導(dǎo)致血小板凝集和血栓形成，促進(jìn)炎性反應(yīng)，并能促進(jìn)腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。C18∶2水平的降低對人體有保護(hù)作用，C20∶5屬于n-3族，其水平升高對人體有保護(hù)作用，可能是長壽的關(guān)鍵因素之一。荊門地區(qū)鐘祥近年來農(nóng)業(yè)植物豆類生產(chǎn)迅速發(fā)展，當(dāng)?shù)鼐用癯３远怪破罚S豆中［12］主要含有 C16∶0(13.45%)、C18∶0(3.34%)、C18∶1(18.61%)、C18∶2(54.10%)、C18∶3(9.69%)，其中C18∶2含量占了50%以上。綜上所述，中國六大長壽區(qū)之一的湖北鐘祥，自然環(huán)境、生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣等方面都適合人的生存，長壽組人群GLU、TC、TG、TFA、UFA等指標(biāo)明顯升高，F(xiàn)FA亞組分中，飽和脂肪酸、C18∶1和 C20∶5升高，而 C18∶2降低，這些因素是長壽的原因之一。

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