EAE大鼠臨床病變與胸腺損傷關(guān)系探討①

袁宏宇 董 梅 劉瑞春 郭 力 郭艷蘇 吳東霞 陳麗萍

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,石家莊 050000）

EAE大鼠臨床病變與胸腺損傷關(guān)系探討①

袁宏宇 董 梅 劉瑞春 郭 力 郭艷蘇 吳東霞 陳麗萍

（河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,石家莊 050000）

目的:研究EAE大鼠發(fā)病后不同時期臨床病變與胸腺損傷之間關(guān)系。方法:觀察正常及EAE發(fā)病后3天、5天及恢復(fù)期大鼠臨床神經(jīng)功能狀態(tài),測量各組大鼠體重、胸腺重量、計算胸腺指數(shù),光鏡下觀察腦組織及胸腺病理變化,采用流式細胞術(shù)檢測各組胸腺細胞凋亡率。結(jié)果:發(fā)病3天及5天大鼠肢體癱瘓,神經(jīng)功能評分分別為2.60±1.22和1.50±0.512,兩組之間無統(tǒng)計學差異。光鏡HE染色顯示發(fā)病3天胸腺顯著萎縮,淋巴細胞數(shù)減少,發(fā)病5天較3天細胞數(shù)量有所恢復(fù),恢復(fù)期組細胞數(shù)明顯增多;發(fā)病3天腦組織大量炎細胞浸潤,發(fā)病5天有多數(shù)袖套樣改變,血管周圍圍繞較多炎細胞,恢復(fù)期炎細胞明顯減少。發(fā)病3天組胸腺指數(shù)較其他組明顯下降（P＜0.05）,其余組胸腺指數(shù)相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。流式細胞術(shù)顯示發(fā)病3天大鼠胸腺細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）,其他組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論:發(fā)病3天大鼠臨床神經(jīng)功能評分及胸腺損傷均較嚴重,大量胸腺細胞凋亡。隨病情發(fā)展,胸腺呈現(xiàn)先萎縮、后恢復(fù)的動態(tài)過程,早于臨床癥狀的恢復(fù),說明胸腺具有自我恢復(fù)性,可以促使疾病緩解,可能參與EAE的發(fā)病過程。

實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎;臨床病變;胸腺;凋亡;病理

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis,MS）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特征的自身免疫性疾病,主要由CD4+T細胞介導,其病因和發(fā)病機制尚未闡明。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimentalallergic encephalomyelitis,EAE）是MS公認的動物模型,MS許多方面的進展是通過對EAE的研究實現(xiàn)的。胸腺是重要的中樞免疫器官,是CD4+T細胞的發(fā)源地。胸腺T細胞通過凋亡途徑去除無自身免疫耐受的細胞,以維持機體的穩(wěn)定。研究表明胸腺與MS有較大關(guān)系:去除胸腺的EAE小鼠失去了病情自然恢復(fù)能力,而存在胸腺的EAE小鼠病情可以緩解[1]。

本研究通過建立EAE模型,采用組織病理學、流式細胞技術(shù)、電鏡等實驗方法觀察EAE大鼠不同發(fā)病時期胸腺的形態(tài)學、凋亡變化規(guī)律、及與大鼠神經(jīng)功能障礙、腦組織病理學改變之間的關(guān)系,探討胸腺損傷與EAE大鼠臨床病變發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及可能的作用,為進一步的實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 從河北醫(yī)科大學實驗動物中心選購約6～8周齡Wistar大鼠 70只[SCXK（冀）2003212003],雌性,體重 180～200克。用新鮮豚鼠的全脊髓制成勻漿加上完全弗氏佐劑（CFA）,佐劑中所含卡介苗量為6mg/m l,乳化后按0.5m l/只分別于大鼠四足墊內(nèi)及背部皮下注射,免疫動物[2]。實驗動物分四組,正常組、發(fā)病3天組、發(fā)病5天組、恢復(fù)期組,每組12～15只。

1.2 神經(jīng)功能評分 所有實驗動物自免疫當日起觀察大鼠的精神狀態(tài)、反應(yīng)是否靈敏,進食水情況,大小便情況、尾部與肢體力量情況等。參照Kono[3]提出的標準,將發(fā)病程度分為5級:Ⅰ級動物尾部無力;Ⅱ級尾部無力+肢體無力;Ⅲ級肢體輕度麻痹;Ⅳ級肢體嚴重麻痹,被動翻身后不能復(fù)原;Ⅴ級瀕死狀態(tài),選取發(fā)病程度Ⅱ級及其以上,按實驗設(shè)計取材。

1.3 標本采集 動物稱重后麻醉并打開胸腔,充分暴露出上端胸骨下呈白色的胸腺,從根部將胸腺完整摘下,稱重,將胸腺分別固定于4%中性甲醛或4%戊二醛中,進行光鏡、電鏡檢查;同時取腦組織固定于4%多聚甲醛中,進行光鏡檢查,以HE染色評估炎癥病變。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料的數(shù)據(jù)用±s表示,神經(jīng)功能評分采用Mann-Whitney U檢驗;胸腺指數(shù),凋亡率多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和SNK-q檢驗。檢驗水準取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能評分 EAE模型組的大鼠免疫后出現(xiàn)精神萎靡、食欲減退、皮毛不光滑、體重下降,于免疫后第16.30±4.10天發(fā)病,出現(xiàn)尾部張力降低、尾部無力,繼之出現(xiàn)后肢、四肢無力、麻痹,大小便失禁,少數(shù)表現(xiàn)為僅雙前肢的無力或癱瘓,無因病情危重而死亡。臨床癥狀評分第3天組與第5天組比較無統(tǒng)計學意義（見表1）。

2.2 組織病理 正常組大鼠神經(jīng)組織病理學未見異常,發(fā)病3天大鼠腦實質(zhì)內(nèi)有大量炎細胞浸潤,彌散分布,部分錐體細胞形態(tài)略變圓頓,發(fā)病5天大鼠腦組織內(nèi)可見多數(shù)“血管袖套”結(jié)構(gòu),周圍有明顯的炎細胞圍繞,恢復(fù)期大鼠腦組織可見少數(shù)散在血管袖套,周圍少量炎細胞浸潤,不同發(fā)病時期病理改變與其臨床癱瘓程度一致,符合臨床特點（見圖1）。

2.3 胸腺指數(shù) 即大鼠胸腺質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量,第三天組大鼠胸腺指數(shù)有顯著升高（P＜0.05）,其余各大組鼠胸腺指數(shù)與正常組相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,（見表2）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分Tab.1 Nervous functional score of different groups

圖1 不同時期EAE大鼠HE染色顯示炎癥改變（HE,×100）Fig.1 Inflammatory changes in brain of normaland EAE rats（HE,×100）

2.4 胸腺光鏡結(jié)構(gòu) 正常組大鼠胸腺結(jié)構(gòu)正常,皮髓質(zhì)分界清楚,皮質(zhì)部染色較深的淋巴細胞密集,核呈藍紫色,髓質(zhì)部染色淺的上皮網(wǎng)狀細胞較多,EAE各組大鼠胸腺細胞結(jié)構(gòu)都發(fā)生不同程度的改變,淋巴細胞和上皮網(wǎng)狀細胞均遭到破壞,第三天組呈現(xiàn)顯著的胸腺萎縮,皮質(zhì)明顯變薄,淋巴細胞數(shù)減少,細胞松散,凋亡細胞數(shù)增多,核染色質(zhì)濃縮,核固縮。而第五天組與第三天組比較凋亡細胞明顯減少,第三天組和恢復(fù)組比較有明顯差異（見圖2）。

2.5 流式細胞術(shù)檢測 結(jié)果顯示各組細胞凋亡率,第3天組大鼠胸腺細胞凋亡率有顯著升高（P＜0.05）,其余兩組胸腺細胞凋亡率相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05,見表3）。

表2 各組胸腺指數(shù)Tab.2 Thymus index of each group

圖2 各組胸腺結(jié)構(gòu)（HE染色,×400）Fig.2 Thymus structure of EAE（HE,×400）

表3 胸腺細胞凋亡率Tab.3 Apoptosis rate of thymus cells

3 討論

MS是以CD4+T細胞介導為主的自身免疫性疾病,基本病理改變?yōu)榘踪|(zhì)炎性脫髓鞘、軸索損傷、膠質(zhì)細胞增生等,好發(fā)于年輕女性,大多數(shù)患者表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)功能障礙,嚴重者可以致殘,病因和發(fā)病機制尚未闡明。

胸腺是重要的中樞免疫器官,是T細胞分化成熟的場所,胸腺細胞經(jīng)過陽性選擇和陰性選擇分化發(fā)育成少量只表達CD4+或CD8+的單陽細胞,即成熟T細胞,使自身具有MHC限制性和自身免疫耐受性,從胸腺遷出后移居到血液和周圍淋巴器官中,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。而大量未成熟T細胞則在分化中通過凋亡機制被清除,胸腺細胞整個發(fā)育過程自始至終受到細胞凋亡機制的監(jiān)控,如果該機制出現(xiàn)紊亂,則將導致自身免疫病發(fā)生。因此,對胸腺形態(tài)改變及細胞凋亡的研究能體現(xiàn)胸腺的功能狀態(tài)。MS的發(fā)病機制尚不清楚,發(fā)生在免疫器官內(nèi)的反應(yīng)尚未可知。MS患者MHCⅡ型限制性由來自胸腺、外周和腦部的抗原呈遞細胞（APC）決定[4]。有關(guān)MS患者胸腺結(jié)構(gòu)和功能變化的研究及對MS發(fā)病機制及神經(jīng)功能障礙影響的報道逐漸增多,其作用仍有待于進一步研究。

胸腺對各種刺激非常敏感,應(yīng)激反應(yīng)、激素、藥物及各種疾病均可致其迅速退化而發(fā)生病理改變[5]。一些學者研究發(fā)現(xiàn)在MS和EAE發(fā)病過程中涉及胸腺結(jié)構(gòu)和功能的改變,并可能對疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生一定的影響。胸腺中持續(xù)的初始T細胞輸出是保證循環(huán)中自身反應(yīng)性T細胞受控制的必要條件。Duszczyszyn[6]觀察了初始T細胞在RRMS患者體內(nèi)的動態(tài)平衡,表明患者早期既有胸腺受累,伴有相應(yīng)的外周T細胞增殖反應(yīng)的代償性自穩(wěn)狀態(tài)破壞,使患者容易發(fā)生自身免疫性疾病。Cavallotti[7]觀察大鼠EAE胸腺的超微結(jié)構(gòu),顯示了許多與EAE發(fā)病機理相關(guān)的變化,如胞漿內(nèi)空泡增多,線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等變化及細胞凋亡和壞死的增加。由此表明MS患者胸腺結(jié)構(gòu)和輸出T細胞功能均下降,可能會對疾病產(chǎn)生一定作用。Tsunoda等[8]研究發(fā)現(xiàn),在SW小鼠RR-EAE中有胸腺萎縮,T、B細胞缺失和大量凋亡。Zimecki等[9]研究發(fā)現(xiàn)給EAE大鼠肌肉內(nèi)注射胸腺提取物（TFX○R）及其六肽片段可以明顯減輕臨床表現(xiàn)、免疫學、病理學和超微結(jié)構(gòu)改變,提示TFX○R及其來源的片段對神經(jīng)變性疾病如MS有潛在的治療作用。CD4+CD25+Foxp3（+）T調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的顯著特征是對具有免疫活性的自身反應(yīng)性T細胞具有抑制作用。研究表明胸腺在口服免疫耐受中具有誘導產(chǎn)生Treg、清除自身免疫性T細胞和輸送初始T細胞的作用[10]。除來自胸腺的Treg細胞,外周來源的Treg在維持免疫平衡中也有重要作用,提示T細胞疫苗接種在MS和風濕性關(guān)節(jié)炎中具有治療前景[11]。Anderton[12]發(fā)現(xiàn)缺乏LFA-1（-/-）的小鼠發(fā)生EAE加重,可能是與胸腺中Treg產(chǎn)生的數(shù)量的減少、對自身抗原免疫反應(yīng)的放大和T細胞對CNS的浸潤所致。Chen等[1]研究表明EAE發(fā)病后胸腺處于一種激活狀態(tài),通過增加胸腺間質(zhì)細胞中IL-7的表達,加速胸腺細胞中Treg細胞的分化和增殖,使輸出的Treg細胞增加,這個過程可以抑制疾病的進展并促進功能的恢復(fù),提示胸腺在EAE中有自我調(diào)節(jié)的功能。Broux[13]最近研究發(fā)現(xiàn)自身穩(wěn)定T細胞受體即IL-7R的基因型與MS相關(guān)。IL-7R多態(tài)性能影響胸腺中T細胞的發(fā)育和自穩(wěn)平衡,導致與MS患者疾病進展一致的免疫調(diào)節(jié)的改變。Korporal[14]研究表明 IFN-β治療MS可以上調(diào)Treg細胞的抑制功能,與增加胸腺來源的初始T細胞和降低記憶T細胞一致,達到維持Treg細胞的自穩(wěn)平衡狀態(tài)。

本實驗動態(tài)研究了不同發(fā)病時期EAE大鼠臨床神經(jīng)功能障礙、腦組織及胸腺病理學改變、胸腺指數(shù)、胸腺細胞凋亡等,探討胸腺損傷與臨床病變之間發(fā)生發(fā)展的關(guān)系,作為研究胸腺在EAE發(fā)病中的作用及可能的機制的基礎(chǔ)。胸腺指數(shù)在一定程度上反映了機體免疫功能的強弱,當胸腺萎縮后培育T淋巴細胞成熟的內(nèi)分泌微環(huán)境遭到破壞,我們發(fā)現(xiàn)在EAE發(fā)病早期即發(fā)病3天時胸腺就發(fā)生嚴重病變,胸腺明顯萎縮變小、胸腺指數(shù)下降和大量胸腺細胞凋亡,表明胸腺結(jié)構(gòu)和功能均受損傷,與大鼠嚴重的臨床表現(xiàn)和較高的神經(jīng)功能評分一致;但胸腺有很強的自我恢復(fù)能力,發(fā)病5天時胸腺迅速恢復(fù)形態(tài),凋亡細胞也相應(yīng)減少,與發(fā)病3天的檢測結(jié)果差異具有統(tǒng)計學意義,而此時臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能評分均改變不明顯,與發(fā)病3天時臨床指標比較無統(tǒng)計學意義;恢復(fù)期胸腺形態(tài)及細胞凋亡水平接近正常,臨床表現(xiàn)也恢復(fù)正常。本實驗表明免疫原在誘發(fā)EAE的同時損傷了胸腺,隨病情的發(fā)生發(fā)展胸腺萎縮,細胞凋亡增多,可能導致免疫耐受異常,加重疾病;在疾病恢復(fù)之前胸腺結(jié)構(gòu)和功能先恢復(fù),早于臨床表現(xiàn)及腦組織病理學改變。凋亡的胸腺細胞呈先降低后恢復(fù)的動態(tài)改變,說明胸腺具有自我恢復(fù)性,可以促使疾病緩解,胸腺可能參與EAE的發(fā)病過程,與EAE發(fā)病有明顯關(guān)系,其機制還需進一步研究。

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[收稿2010-08-10 修回2011-01-25]

（編輯 倪 鵬）

Study the relationship of clinical disease and the injury of thymus in EAE rat

YUANHong-Yu,DONGMei,LIURui-Chun,GUOLi,GUOYan-Su,WUDong-Xia,CHENLi-Ping.DepartmentofNeurology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective:To study the relationships between clinical diseaseand injury of thymus in different stageof experimental allergic encephalomyelitis（EAE）.Methods:Observing clinical nervous functional scores of different groupswer observed,aftermeasuring the body weights of rats,the thymuswere taken outandweighted it,thenweaccounted the thymus index.Weobserved the brain and thymus in lightm icroscopy to compare the changes in differentgroups.The apoptotic cells of thymusweremeasured by flow cytometry in different groups.Results:EAE ratwere paralyzed at different levelboth in the third day group and the fifth day group,the clinical scoreswere 2.60±1.22 and 1.50±0.512 respectively and they had no statistical significance.Significantatrophy and the numbers of lymphocytes of thymuswere seen in the third day group in lightmicroscopy.The lymphocytes increased in the fifth day group but theywere still lower than in the recovery group.There were increased lymphocytes and tight structure in recovery group.A lot of inflammatory cellswere seen in brain in the third day group;many perivascular cuffingswere in tissuesand they wereenclosed by inflammatory cells in fifth day group;therewereobviously diseased inflammatory cells in recovery group.Thymus indexwas lower in the third day group than in other groups（P＜0.05）and therewere no statistical significance in other threegroups.The apoptotic rateof thymus cellswas higher in the third day group than in other threegroups（P＜0.05）,there wereno statistically significant in other threegroups（P＞0.05）.Conclusion:The rat thymuses of EAEwere atrophy first and got improved.The recovery of thymuswas earlier than clinical symptomswhich showed that the thymuswere recoverable.The thymusmay participate in the course of EAE.

Experimental allergic encephalomyelitis;Clinical disease;Thymus;Apoptosis;Pathology

R744.5

A

1000-484X（2011）05-0459-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.018

①本文受河北省科技廳資助項目（No.08276101D-2）

袁宏宇（1984年-）,男,碩士,主要從事脫髓鞘疾病研究;

及指導教師:董 梅（1969年-）,女,博士,副主任醫(yī)師,主要從事脫髓鞘疾病研究。