rAV-Tumstatin病毒載體對(duì)裸鼠膀胱移植癌治療作用的初探①

李 志 魏 巍 劉祿成 郭 航 張 明 楊 瀟 黃海龍

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,長(zhǎng)春 130041）

·移植免疫學(xué)·

rAV-Tumstatin病毒載體對(duì)裸鼠膀胱移植癌治療作用的初探①

李 志 魏 巍 劉祿成 郭 航 張 明 楊 瀟 黃海龍

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科,長(zhǎng)春 130041）

目的:探討重組腺病毒攜帶腫瘤抑素（rAV-Tumstatin）對(duì)裸鼠膀胱移植癌的治療效果。方法:構(gòu)建裸鼠膀胱移植癌模型,隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組,記錄腫瘤重量和體積,流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果:裸鼠膀胱移植癌模型構(gòu)建成功,rAV-Tumstatin病毒載體治療組移植性膀胱癌生長(zhǎng)受到明顯抑制,腫瘤重量和體積明顯小于對(duì)照組（P＜0.01）,FCM檢測(cè)治療組腫瘤細(xì)胞G1-S期進(jìn)程受阻,增殖率下降,凋亡率上升,與對(duì)照組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論:攜帶rAV-Tumstatin載體通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡,發(fā)揮對(duì)裸鼠移植性膀胱癌的治療作用。

膀胱腫瘤;裸鼠·模型;腫瘤抑素;腺病毒載體

膀胱移行細(xì)胞癌（Transitional cell carcinomaof the bladder,BTCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1]。目前膀胱癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制尚未完全明確,對(duì)其發(fā)生率居高不下和治療后多次復(fù)發(fā)的生物學(xué)基礎(chǔ)尚缺乏廣泛深入的研究。近年有研究指出:腫瘤抑素（Tumstatin）是一種內(nèi)源性的血管生成抑制因子與細(xì)胞凋亡啟動(dòng)子,具有2個(gè)抗腫瘤活性區(qū),不僅通過特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞蛋白合成導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,使腫瘤新生血管形成受阻,還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,從而遏制腫瘤生長(zhǎng),有可能給腫瘤的治療帶來新的希望[2,3]。但目前尚未見到Tumstatin在BTCC研究方面的文獻(xiàn)報(bào)道。最近我們選用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了rAV-Tumstatin病毒載體,并就其生物活性對(duì)BTCC細(xì)胞株T24的影響進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明,rAV-Tumstatin在體外能抑制膀胱癌T24細(xì)胞株增殖并誘導(dǎo)其凋亡,對(duì)膀胱癌基因治療的研究具有一定的價(jià)值[4]。為進(jìn)一步探索其在體內(nèi)的作用,本實(shí)驗(yàn)以裸鼠移植性膀胱癌為模型,觀察重組腺病毒攜帶腫瘤抑素（rAV-Tumstatin）對(duì)腫瘤的治療作用,為其作為抗腫瘤的基因治療藥物應(yīng)用于臨床膀胱癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 rAV-Tumstatin病毒載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[4]。人膀胱癌細(xì)胞株T24購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。BALB/c裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和流式細(xì)胞儀均為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 方法 ①裸鼠膀胱癌移植模型建立的方法步驟按參考文獻(xiàn)[5]所述,即苯巴比妥鈉麻醉后,無菌條件下F8號(hào)導(dǎo)尿管通過尿道插入膀胱,用酸性液體處理膀胱造成粘膜局部損傷,向損傷部位注入經(jīng)胰酶消化制成濃度為5×106ml-1的處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌細(xì)胞株T24懸液0.2ml。7天時(shí)開始成瘤,28天時(shí)對(duì)照組和治療組腫瘤分別生長(zhǎng)至直徑1.5 cm和0.9 cm大小。②把開始成瘤的30只裸鼠隨機(jī)分為治療組（20只）和對(duì)照組（10只）,兩組每隔4天分別注入rAV-Tumstatin病毒載體治療和生理鹽水對(duì)比,5次20天為一個(gè)療程,療程結(jié)束后處死全部裸鼠,分離出瘤體,檢測(cè)腫瘤重量和體積。③采用FCM分別檢測(cè)腫瘤細(xì)胞周期和凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,腫瘤重量和體積及細(xì)胞增殖率和凋亡率以±s表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植癌的生長(zhǎng)情況 30只裸鼠種植人膀胱癌細(xì)胞株T24后7天開始觀察,膀胱黏膜損傷部位均有病灶形成,并經(jīng)病理檢查證實(shí),瘤細(xì)胞種植成功率100%。第28天時(shí)處死裸鼠,分離出瘤體稱重,同時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并計(jì)算瘤體積。治療組腫瘤重量為（1.28±0.47）克,體積為（1 097.64±283.75）mm3,空白對(duì)照組腫瘤重量為（2.17±1.58）克,體積為（2 459.38±1 649±1 374.15）mm3。治療組腫瘤的重量和體積明顯低于對(duì)照組,組間比較差異有顯著性（P＜0.01）,提示rAV-Tumstatin病毒載體對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有良好抑制作用。

2.2 癌組織中細(xì)胞凋亡率的變化 FCM結(jié)果顯示:rAV-Tumstatin病毒載體組治療后,腫瘤細(xì)胞凋亡率為（27.5±1.4）%,而未治療組即對(duì)照組只有（9.3±0.7）%,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,顯示rAV-Tumstatin病毒載體在體內(nèi)能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,延緩腫瘤生長(zhǎng)。

2.3 腫瘤細(xì)胞周期檢測(cè) FCM檢測(cè)兩組裸鼠移植瘤的細(xì)胞周期結(jié)果是:治療組G0/G1期57.82%±3.91%,S期14.08%±21.73%,G2/M期6.38%±2.04%;對(duì)照組G0/G1期 39.04%±8.35%,S期26.19%±3.27%,G2/M期7.24%±5.08%。組間不同細(xì)胞周期比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）,表明rAV-Tumstatin病毒載體具有通過調(diào)控細(xì)胞周期使細(xì)胞G1-S期進(jìn)程受阻從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的生物活性。

3 討論

裸鼠是嚴(yán)重免疫缺陷的小鼠,沒有異種間移植組織的免疫排斥反應(yīng),移植后細(xì)胞成活率高,在本實(shí)驗(yàn)中成瘤率達(dá)到100%。在裸鼠膀胱內(nèi)移植并生長(zhǎng)的人膀胱癌細(xì)胞株T24形態(tài)與人類的膀胱移行細(xì)胞癌形態(tài)具有驚人的相似,能保持原有的組織細(xì)胞形態(tài)與特征,所以實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能對(duì)臨床有一定的參考價(jià)值。

腫瘤抑素（Tumstatin）是 2000年由 Maeshima等[6]從腎小球基底膜中分離出來的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子。是近年來發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的血管生成抑制因子之一,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性的抑制作用,已在腫瘤的抗血管生成治療中得到廣泛應(yīng)用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明,該蛋白除具有突出的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖功能外,還具有明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的生物活性,故其作為腫瘤抑制基因在腫瘤治療中的作用和地位得到進(jìn)一步重視和加強(qiáng)[7,8]。

本文作者選擇攜帶腫瘤抑素基因的重組腺病毒載體,觀察其對(duì)模型裸鼠膀胱移植癌的治療作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用rAV-Tumstatin病毒載體治療的裸鼠,其腫瘤重量和體積比對(duì)照組明顯降低（P＜0.01）,腫瘤細(xì)胞增殖率和凋亡率與對(duì)照組相比,差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)初步展示了Tumstatin基因?qū)β闶蟀螂滓浦舶┑牧己弥委熜Ч?。該基因也可能成為臨床上治療膀胱癌的一個(gè)新的選擇。不過值得一提的是,動(dòng)物與人基因型、表型、免疫力以及對(duì)惡變細(xì)胞監(jiān)督和清除的機(jī)理與能力存在差異,而且裸鼠膀胱癌模型的建立是一個(gè)被動(dòng)的成瘤過程,人膀胱癌則是在自然條件下主動(dòng)形成的,再者,兩種癌發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境不同,所以本實(shí)驗(yàn)成績(jī)能否真正為臨床帶來幫助,甚至成為膀胱癌病人的福音,無疑還需要做更多、更深入的工作。

1 Takushi U,Kazutaka H,Fumiatsu Oetal.Diagnosing the location of carcinoma in situ（CIS）of the urinary bladder using pirarubicin hydrochloride[J].Urol Int,2005;74:235-239.

2 Sudhakar A,Boosani C S.Inhibition of tumor angiogenesis by tumstatin:insights into signaling mechanisms and.implications in cancer regression[J].Pharm Res,2008;25（12）:2731-2739.

3 Eikesdal H P,Sugimoto H,Birrane Getal.Identification of am ino acids essential for the antiangiogenic activity of tumstatin and itsuse in combi-nation antitumor activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008;105（39）:15040-15045.

4 任 明,劉祿成,魏 巍etal.rAV-Tumstatin病毒載體構(gòu)建及其生物活性檢測(cè)[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2010;36（3）:453-456.

5 朱德淳,梁 新,劉祿成etal.荷瘤裸鼠膀胱癌原位模型的建立及VEGF siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）,2007;33（5）:860-862.

6 Maeshima Y,Colorado PC,Torre Aetal.Distinct antitumor propertiesof a typeⅣcollagen domain derived from basement membrane[J].Biol Chem,2000;75（28）:21340-21348.

7 Meng J,Ma N,Yan Zetal.NCR enhanced the anti-angiogenicactivity of tumstatin[J].JBiochem,2006;140（2）:299-302.

8 Lou YQ,Wang LH,Ma X Letal.Construction expression and characteri-zation of a new targeted bifunctional fusion:tumstatin15-132-TNF[J].IUBMB Life,2006;58（11）:647-652.

[收稿2010-08-16 修回2011-01-20]

（編輯 倪 鵬）

The cure effect of rAV-Tumstatin viral vector on bladder tansplanted tumor in nude m ice

LIZhi,WEIWei,LIULu-Cheng,GUOHang,ZHANGMing,YANGXiao,HUANGHai-Long.DepartmentofUrology,theSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China

Objective:To investigate the cureeffectof recombinantadenoviruswhich carried with rAV-Tumstatin onb ladder transplanted tumor in nudem ice.Methods:Transplanted tumormodelof bladder canceron nudemicewas setup,and been divided into treated group and controlgroup random ly.Tumormass and volum were recorded.Tumor cell cycle and apoptosisweremeasured by FCM.Results:Transplanted tumormodel of bladder canceron nudem icewas setup successfu lly.Thegrowthof transplanted tumor among rAV-Tumstatin virusvector treated groupweremarkly suppressed.The tumormass and volumewere significantly smaller than control group（P＜0.01）.It showed cell cyclearrest on G1-Sphase in treated group,growth ratewere reduced and apoptotic indexwere increased.Therewere statisticly significance comparedwith control group（P＜0.01）.Conclusion:Vector carried with rAV-Tumstatin cou ld suppress tomor cell proliferation and induced its apoptosis.So ithad cure effecton transplanted bladder tumor.

Bladder cancer;Nudem ice·model;Tumstatin;Adenovirus vector

R373.14

A

1000-484X（2011）05-0438-02

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.013

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972981）

李 志（1962年-）,男,醫(yī)學(xué)學(xué)士,副教授,主要從事泌尿系腫瘤的治療研究。

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·