靈丹散對(duì)四氯化碳致肝損傷大鼠肝功能及肝纖維化的影響*

何穎穎 李 鋒△ 馬 亮 孫香蕾 石德祥

1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院（陜西西安710023）

2陜西省結(jié)核病防治院（陜西西安710023）

靈丹散是西京醫(yī)院中醫(yī)科經(jīng)驗(yàn)處方，屬于散劑、協(xié)議處方，具有扶正化瘀之功，用于多種原因所致肝硬化的防治和早期肝硬化的治療，多年的臨床應(yīng)用表明其具有明顯的療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過對(duì)四氯化碳致肝損傷大鼠血清肝功能指標(biāo)及肝纖維化指標(biāo)的檢測(cè)，觀察靈丹散對(duì)肝纖維化的治療作用。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物 雄性 SD大鼠 40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量 140～160g，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)飼養(yǎng)。

1．2 藥物與試劑 靈丹散由靈芝、丹參、田基黃、苦參、當(dāng)歸、柴胡、五味子、鱉甲、山藥、茯苓組成，經(jīng)醇提、水提、打粉，再混合制成粉劑，由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所制備。用前以生理鹽水沖調(diào)。復(fù)方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20020501，用前研粉以生理鹽水溶解。四氯化碳分析純，購自天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1．3 模型制備［1］大鼠分為正常對(duì)照組、模型組、復(fù)方鱉甲軟肝片組、靈丹散組，每組10只。模型大鼠首次皮下注射60%CCl4橄欖油溶液5mL/kg，其后60%CCl4橄欖油溶液3mL/kg，每周2次，共8周，正常對(duì)照組皮下注射等量純橄欖油。各組均為普通飲食，自由飲水。

1．4 給藥方法 造模第4周起，復(fù)方鱉甲軟肝片組灌胃復(fù)方鱉甲軟肝片0．6g/kg（相當(dāng)于成人臨床用量的6倍）；正常對(duì)照組、模型組灌胃同體積生理鹽水；靈丹散組灌胃靈丹散藥粉0．6g/kg。每日1次，共給藥5周。

1．5 檢測(cè)方法 肝功能：西京醫(yī)院檢驗(yàn)科試劑盒方法檢測(cè)。肝纖維化：透明質(zhì)酸（HA）、層黏蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（C-Ⅳ）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）聯(lián)合檢測(cè)采用放射免疫分析法，試劑盒購自北京北方生物制品研究所，所用儀器由核工業(yè)部西安二六二廠生產(chǎn)，型號(hào)為：XH6080。肝臟病理學(xué)觀察：HE染色，包括以下6個(gè)主要步驟：（1）取材；（2）固定；（3）脫水透明；（4）浸蠟、包埋；（5）切片和貼片；（6）染色和封片，然后在光鏡下觀察肝臟組織的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，肝小葉及間質(zhì)有無異常。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠存活情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，正常組10只大鼠全部存活，模型組大鼠存活7只，復(fù)方鱉甲軟肝片對(duì)照組及靈丹散組各8只存活。

2．2 靈丹散對(duì)大鼠血清肝功能的影響 見表1。肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組較正常組血清天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）活性升高（P＜0．05），總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（G）含量降低（P＜0．05）；靈丹散組與模型組比較，AST、ALT、ALP 活性明顯降低（P＜0．05），TP、Alb、G含量升高（P＜0．05）。

表1 各組肝功能指標(biāo)比較 （±s）

表1 各組肝功能指標(biāo)比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0．05。 下同。

（mg/L）36．54±0．56*28．66±2．79*30．80±1．70 20．13±2．89*復(fù)方鱉甲軟肝片組 8 64．41±1．52* 36．87±0．68* 27．41±1．24*靈丹散組 8 57．45±1．06*35．28±0．68*23．17±0．80*ALT（U/L）19．50±1．29*191．40±18．82 47．17±6．80*40．40±12．92*組 別n Alb（mg/L）G正常對(duì)照組模型組10 7 AST（U/L）162．40±11．31*347．80±25．78 147．17±13．23*151．25±15．15*ALP（U/L）114．20±8．35*347．83±73．36 109．33±9．97*124．75±4．99*TP（mg/L）65．08±2．45*49．58±4．45

2．3 靈丹散對(duì)大鼠肝纖維化指標(biāo)的影響 見表2。模型組較正常組血清 HA、LN、C-Ⅳ、PCⅢ均有明顯上升（P＜0．05），正常對(duì)照組及靈丹散組與模型組比較，HA、LN、C-Ⅳ、PCⅢ有明顯下降（P＜0．05），但正常對(duì)照組與靈丹散之間無明顯差異。

2．4 病理組織觀察 正常對(duì)照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞條索排列規(guī)則有序；模型組肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性，炎癥細(xì)胞浸潤，可見肝細(xì)胞壞死區(qū)、匯管區(qū)有纖維結(jié)締組織增生，肝細(xì)胞條索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂。復(fù)方鱉甲軟肝片組及靈丹散組的鏡下表現(xiàn)為輕度脂肪變性，膠原纖維沉積減少，有少量炎細(xì)胞浸潤，兩組肝組織病理變化相似。

表2 各組肝纖維化指標(biāo)比較 （ng/mL，±s）

表2 各組肝纖維化指標(biāo)比較 （ng/mL，±s）

C-Ⅳ PC-Ⅲ8．26±1．02*43．55±2．01*10．95±1．78 47．29±1．64復(fù)方鱉甲軟肝片組 8 30．63±6．76*52．67±2．96* 9．37±0．88*44．11±1．57*靈丹散組 8 32．79±6．66*54．31±4．79* 9．22±0．79*43．03±2．45*組 別正常對(duì)照組模型組n 10 7 HA 33．41±1．24*57．49±22．94 LN 53．13±2．53*65．49±6．12

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝纖維化初起多為濕熱、疫毒，或?yàn)闅鈾C(jī)不暢而致肝血瘀阻，血瘀日久又可致正氣虛損，故治療多從扶正化瘀入手，兼以清熱解毒［2］。靈丹散組成藥物中，靈芝［3］、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血，山藥、茯苓健脾益氣；當(dāng)歸補(bǔ)血活血；丹參［4］、鱉甲活血化瘀；柴胡疏肝理氣；苦參、田基黃清利濕熱，又有解毒之功，諸藥相伍，可收扶正化瘀、清熱解毒利濕之功。

本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠存在明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，其原因在于CCl4在肝內(nèi)的代謝裂解產(chǎn)物所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，過氧化反應(yīng)產(chǎn)物不但可破壞肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起肝細(xì)胞脂肪變性，更可直接刺激肝星狀細(xì)胞生成膠原，從而導(dǎo)致肝纖維化的病變。而復(fù)方鱉甲軟肝片組、靈丹散組大鼠肝細(xì)胞脂肪變明顯減輕，纖維化改變不明顯，這可能是方劑整體抗肝纖維化的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)，肝纖維化病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，靈丹散有保護(hù)肝臟細(xì)胞，降低肝細(xì)胞脂肪變性程度，改善肝纖維化病理狀態(tài)，降低血清ALT、AST，促進(jìn)白蛋白的合成等作用，說明其具有明確可靠的抗纖維化療效，但其作用的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

［1］ 金峰，張捷，張志堅(jiān)，等．四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型方法的研究［J］．中華實(shí)用醫(yī)學(xué)，2003，5（16）：43-44．

［2］ 馬健，左冬冬．中醫(yī)藥治療肝纖維化的研究進(jìn)展［J］．醫(yī)學(xué)研究雜志，2008，5（37）：103-104．

［3］ 陳潔，史楊娟，羅琳，等．靈芝三萜對(duì)大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］．中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28 （9）：694-697．

［4］ 陶艷艷，劉成海．丹參及其化學(xué)成分抗肝纖維化作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］．中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2004，3（2）：145-148．