圓環(huán)病毒2型SD/2008株在人工感染仔豬組織器官中的分布

梁方印 尹秀玲 康 敏 宋慶華

（河南濮陽縣畜牧局，河南濮陽 457000）

圓環(huán)病毒2型SD/2008株在人工感染仔豬組織器官中的分布

梁方印 尹秀玲 康 敏 宋慶華

（河南濮陽縣畜牧局，河南濮陽 457000）

自1991年harding首次報(bào)道加拿大發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）以來，豬圓環(huán)病毒2型（Porcine cirovirus type 2,PCV-2）感染及其所致疾病已遍及世界各地，成為危害世界養(yǎng)豬生產(chǎn)的一大疫病。我國對PCV-2的研究始于1999年年底，有學(xué)者對我國部分豬群的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)豬群中廣泛存在PCV-2抗體。PCV-2是PMWS的主要致病病原，在臨床上主要感染5～12周齡的斷奶仔豬。2008年重慶、新疆、湖南、浙江、廣東、上海、遼寧、黑龍江、福建等10多個(gè)省市自治區(qū)先后發(fā)現(xiàn)了豬群混合感染該病的病例。陳煥春等人2003年～2008年的臨床病例分析，發(fā)現(xiàn)我國圓環(huán)病毒抗體陽性率達(dá)到37.92% （1792/4726），病原陽性率達(dá)到23.8% （360/1510），且呈逐年上升的趨勢。由此可見，PCV-2在我國豬群的感染情況已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重。因此，我們有必要對PCV-2進(jìn)行繼續(xù)的研究。

本研究旨在使用免疫組化技術(shù)分析PCV-2感染豬病毒抗原在豬各重要器官及組織中的分布，從細(xì)胞水平揭示PCV-2感染對豬機(jī)體各器官組織的嗜性，為研究PCV-2的致病性提供幫助。

目前，實(shí)驗(yàn)室對PCV-2抗原的常規(guī)診斷技術(shù)包括：1）間接免疫熒光（Indirect immunofluorescent antibody,IFA）技術(shù)；2）聚合酶鏈反應(yīng) （Polymerase chain reaction,PCR）；3）原位核酸雜交檢測技術(shù)；4）限制性長度多態(tài)性 分 析 （Restriction fragment lengt hpolymorphism,RFLP）；5）基因芯片檢測技術(shù)；6）免疫膠體金技術(shù) （Immune colloidal gold technique,ICGT）；7）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）；8）免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)；9）免疫組織化學(xué)方法等。前八種方法對實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)人員要求高，操作程序復(fù)雜，不易在基層單位普及，但是免疫組織化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry,IHC）是在抗原抗體特異反應(yīng)存在的前提條件下，借助于酶細(xì)胞化學(xué)的手段，于光鏡下觀察分析檢測某物質(zhì)在組織細(xì)胞內(nèi)存在部位的一門技術(shù)，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，簡單易行等特點(diǎn)，能將形態(tài)研究與功能、代謝研究有機(jī)地結(jié)合在一起，具有更大的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)以兔抗豬圓環(huán)病毒2型ORF2（PCV-2-ORF2）重組蛋白的特異性抗體作為一抗，將辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，探索通過IHC的方法檢測豬圓環(huán)病毒2型 （PCV-2）抗原，以期建立實(shí)驗(yàn)室對PCV-2病毒抗原進(jìn)行準(zhǔn)確的定性，以及對抗原的動(dòng)態(tài)分布進(jìn)行準(zhǔn)確定位的診斷方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1病毒

豬圓環(huán)病毒2型SD/2008株，病毒滴度 （TCID50）為105.61/0.1 mL。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物

6頭35日齡健康杜洛克×長白雜交豬，經(jīng)PCR檢測PCV-2、PPV、PRV、PRRSV及CSFV核酸均呈陰性，ELISA檢測血清抗PCV-2抗體為陰性。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

YD-12P全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)（購自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；YD-6L全自動(dòng)生物組織冷凍包埋機(jī)（購自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；YD-1508R輪轉(zhuǎn)式切片機(jī) （購自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；恒溫箱 （購自上海智城分析儀器制造有限公司）；一次性切片刀片 （日本羽毛牌）；YD-A攤片機(jī) （購自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；YD-B烤片機(jī) （購自浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；電子天平 （購自上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；顯微鏡及數(shù)碼顯微照相系統(tǒng) （購自北京麥克奧迪公司）；YABO700電腦自動(dòng)染色機(jī) （購自常州市雅博電子設(shè)備有限公司）；載玻片 （規(guī)格：25.4×76.2 mm）用多聚賴氨酸處理。將APES用丙酮1: 50稀釋，取干凈的玻片浸泡30分鐘，取出后略干燥一會(huì) （視溫度而定，一般1～5分鐘）。純丙酮涮洗2～3次。撈出后無塵處干燥或烘烤，密閉后可保存半年以上。每次的稀釋液均必須新鮮配制。

其它用具：蓋玻片、切片刀、鑷子、剪刀、毛筆、包埋盒、包埋皿、染缸及染液、酒精燈、高壓鍋、通風(fēng)櫥等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

1%H2O2-甲醇

17mLH2O2（30%）加入500 mL甲醇4℃保存。

PBS （無疊氮化鈉， pH 7.2～7.4，10倍濃度）：

加入蒸餾水定容至1 000 mL，121℃高壓滅菌。貯藏于4℃冰箱中，用前稀釋10倍。

用0.1 mol/L的NaOH將pH調(diào)至7.8。

10×DAB貯存液

稱取50 mg DAB（sigma）溶于10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液 （pH=7.4）中，此為10倍溶液，分裝0.5mL安培管中，貯于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

用時(shí)稀釋。取0.5 mL 10×DAB貯存液加入4.5 mL （pH=7.4）Tris-HCl緩沖液，可以用濾膜注射器或300 rpm離心5分鐘，取上清。加入15μL 30%的 H2O2，此后立即使用。每張切片滴加4滴，覆蓋切片，放置15～30分鐘，至顯棕色為止。也可在10 mL DAB溶液中加入2滴30%的H2O2，即30%W/V H2O2（100 volume），加在切片上5分鐘后觀察顯色情況。也可在顯微鏡下檢查陽性標(biāo)本染色情況。

蘇木素染液

甲液（蘇木素0.9 g，無水乙醇10 g）

乙液（硫酸鋁鉀20 g，蒸餾水200mL）

配制時(shí)分別配好甲、乙兩液，然后將甲，乙液混合并加熱煮沸，帶液體沸騰后將盛液體的燒杯移開火焰，緩緩加入氧化汞1.25 g，并攪拌均勻，直至氧化汞完全溶解后再將燒杯迅速放入冷水中冷卻，放置第二天過濾即可。注意加入冰醋酸20mL可使細(xì)胞核著色好。

4%多聚甲醛

40 g多聚甲醛溶于 0.1 mol/L PBS（不含鉀）中，于60～65℃加熱攪拌溶解（用NaOH調(diào)pH 7.0～7.4），定容到1 000 mL，4℃保存待用。

載玻片

將APES用丙酮1：50稀釋，取干凈的玻片浸泡30分鐘，取出后略干燥一會(huì) （視溫度而定，一般1～5分鐘）。純丙酮涮洗2～3次。撈出后無塵處干燥或烘烤，密閉后可保存半年以上。每次的稀釋液均必須新鮮配制。

其它材料

乙醇：質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度溶液為 （70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇）；二甲苯：1:1的二甲苯和乙醇溶液；1%鹽酸酒精；石蠟；冰醋酸；中性樹脂；豬PCV陽性血清；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG血清；兔抗PCV-2多克隆抗體，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物感染

將6頭35天的健康仔豬隨機(jī)分為PCV-2感染組和非感染對照組，每組3頭。將豬圓環(huán)病毒2型SD/2008株經(jīng)口鼻途徑接種感染組豬，對照組用RPMI 1640培養(yǎng)基以相同接種途徑接種，攻毒劑量為3mL/只。兩組豬進(jìn)行嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)方法與飼養(yǎng)條件完全相同。接種病毒后35天分別剖殺感染組和對照組。采集淋巴結(jié) （下頜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)）、肝、脾、肺、腎做石蠟切片。

2.2待檢組織石蠟切片的制備

取待檢的組織塊置于10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)以上，然后脫水、透明、浸蠟、包埋。每份樣品制備厚度為4μm的切片2張，做免疫組織化學(xué)染色。

2.2.1組織切片的制作

2.2.1.1取材

PCV-2感染豬后35天，剖殺感染組和對照組豬，分別按規(guī)格取各組豬的肝、脾、肺、腎、腦、腸、淋巴結(jié)等組織作為制片材料，并實(shí)施編號(hào)以防混亂。病料組織大小為1 cm×1 cm×0.3 cm。

2.2.1.2固定

固定液采用新配的4%新鮮甲醛溶液，將采取病料固定24小時(shí)以上。固定液的用量為材料的20～30倍。

2.2.1.3 脫水

常規(guī)梯度乙醇脫水，采用逐級(jí)提高酒精濃度 （70%→80%→90%→95%→100%）進(jìn)行樣本脫水，脫水時(shí)間分別為2小時(shí)。

2.2.1.4透明

透明劑選取的是二甲苯，透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，各級(jí)停留時(shí)間在30分鐘至2小時(shí)，在純二甲苯中更換2次，總時(shí)間為3小時(shí)。

2.2.1.5浸蠟

充分浸蠟，時(shí)間為2～3小時(shí)。此步驟是在溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度調(diào)至60℃，恰好使石蠟溶解。

2.2.1.6包埋

包埋之前應(yīng)將包埋皿與包埋鑷子一起放在溫箱中加熱?？焖僬J(rèn)真地將組織埋入石蠟，凝固成塊。

2.2.1.7 切片

2.2.1.7.1 石蠟塊的固著與修整

固著：用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后切出所需的片子。

修整：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2.5 mm的石蠟，修好的蠟塊呈長方形。再削去一小角以便于分離蠟帶。

2.2.1.7.2 切片方法

切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺的部分來進(jìn)行切削。將所要切的包埋塊固定在標(biāo)本臺(tái)上，使包埋塊外切面與標(biāo)本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺(tái)推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動(dòng)裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度4μm，調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)注意指針不可在兩個(gè)刻度之間，將刀臺(tái)移至近標(biāo)本臺(tái)處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，開始切片。右手轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉(zhuǎn)動(dòng)，持另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機(jī)劇烈震動(dòng)引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動(dòng)的方向，以防標(biāo)本臺(tái)后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)擦凈。

2.2.1.8貼片

采取撈片法，即首先將切片分割開，投入到42℃的溫水浴中，這時(shí)切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用先前處理好的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于37℃恒定的燙板上讓切片攤干，之后移入37℃恒溫箱中烤片24小時(shí)。

2.3免疫組化 （IHC）染色

石蠟切片放入二甲苯Ⅰ作用15分鐘；二甲苯Ⅱ作用15分鐘；無水乙醇作用2分鐘；95%乙醇作用2分鐘；85%乙醇作用2分鐘；75%乙醇作用2分鐘；蒸餾水作用2分鐘。

切片浸于1%H2O2-甲醇 （消除內(nèi)源性過氧化物酶）液體中，室溫作用30分鐘；洗滌液 （0.01 mol pH=7.4 PBS，含0.05%Tween-80）洗3～4次，每次3～5分鐘。

切片組織上方滴加0.1%～0.25%胰酶溶液 （PBS配制，含0.1%氯化鈣，pH=7.8，用前預(yù)溫至37℃）37℃作用15分鐘 （暴露抗原）。

同上洗滌后加封閉液 （0.01 mol pH=7.4 PBS配制的1%BSA），放入濕盒中，37℃作用30分鐘。

甩去封閉液，不經(jīng)洗滌直接加適量經(jīng)稀釋 （稀釋液為0.01 mol pH=7.4 PBS配制的0.1%BSA,含0.05%Tween-80）的一抗 （1:100、1:200、1:400、1:800），放入濕盒中，37℃45分鐘 （或4℃過夜）。

同上洗滌后，加適量經(jīng)稀釋 （稀釋液為0.01 mol pH=7.4 PBS配制的0.1% BSA，含0.05%Tween-80）的二抗（HRP標(biāo) 記 的 羊 抗 豬 IgG） （1:100、1:200），放入濕盒中37℃30～45分鐘。

經(jīng)洗滌后加新鮮配制的DAB溶液，避光作用5～15分鐘，于蒸餾水中終止顯色 （2分鐘以上）。

用harris蘇木素作用適當(dāng)?shù)囊r染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗、晾干，用含二甲苯的中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

2.4免疫組化結(jié)果的判定方法

在光學(xué)顯微鏡下，出現(xiàn)棕黃色信號(hào)的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，表示其內(nèi)有PCV-2存在。隨機(jī)選3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的百分率，代表該組織器官內(nèi)PCV-2的含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 器官組織剖檢變化

如表1所示，接種后35天將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剖殺，發(fā)現(xiàn)其肝臟有不同程度的虎斑狀病變；腹股溝淋巴結(jié)輕微腫大；頜下淋巴結(jié)腫大或壞死；脾臟大頭明顯腫大，小頭呈鋸齒狀，大頭脾門淋巴結(jié)梗死；肺臟嚴(yán)重肉變，整個(gè)肺呈花斑樣淤血出血，右側(cè)隔葉灰黃色病灶，左側(cè)尖葉氣腫；腎臟大部分呈黃色，皮質(zhì)出現(xiàn)米粒大的壞死灶。對照組豬無肉眼明顯可見的剖檢病變。

3.2部分豬組織器官中PCV-2的免疫組化檢測結(jié)果

表1 感染35天 （dpi）PCV-2感染豬器官組織的剖檢病變

表1 感染35天 （dpi）PCV-2感染豬器官組織的剖檢病變

用免疫組化方法檢測攻毒后各組豬的淋巴結(jié) （頜下淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)）、肝、脾、 肺、腎、等免疫器官中PCV-2的分布，檢測結(jié)果見圖1～4和表2，PCV-2 SD/2008株能感染多種組織，在仔豬的頜下淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)、肝、脾、肺等組織中都能檢測到大量病毒抗原。PCV-2在豬體內(nèi)的主要靶細(xì)胞是單核/巨噬細(xì)胞，在IHC陽性組織中，病毒抗原主要定位于各種上皮組織，例如頜下淋巴結(jié)巨噬細(xì)胞，肺泡內(nèi)淋巴細(xì)胞及細(xì)支氣管上皮細(xì)胞，腹股溝淋巴細(xì)胞，肝巨噬細(xì)胞等，在各組織中，淋巴組織應(yīng)是該病毒的主要靶組織，這些病毒抗原陽性組織多數(shù)伴隨明顯的組織損傷，其中以頜下淋巴結(jié) （圖1）和肺臟 （圖2）的陽性染色最強(qiáng)，組織損傷也最嚴(yán)重?？瞻讓φ战M仔豬被檢組織IHC染色結(jié)果均為陰性。

3.3組織器官中PCV-2的含量

PCV-2 SD/2008株感染的仔豬，在接毒后各組豬的淋巴結(jié) （頜下淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)）、肝、脾、肺、腎、等免疫器官中PCV-2含量見表3。

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接毒后在仔豬的頜下淋巴結(jié)和肺臟中檢測到大量的陽性細(xì)胞，PCV-2的含量高達(dá)31%和25%；在腎臟中PCV-2的含量較低，僅為4%，在一定程度上體現(xiàn)了PCV-2 SD/ 2008株在人工感染仔豬體內(nèi)的分布的特性及感染特性，為進(jìn)一步研究其致病性提供一定的依據(jù)。

4 討論

4.1 石蠟切片中應(yīng)注意的問題

取材時(shí)病料組織的大小要合適，一般為1 cm×1 cm×0.3 cm，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部；要求新剖殺且新鮮的組織；切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷而發(fā)生形態(tài)改變。

固定時(shí)為了使標(biāo)本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織細(xì)胞，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。固定時(shí)，須注意以下幾點(diǎn)：1）固定劑應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍；2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液；3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出；4）固定時(shí)間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時(shí)到幾十小時(shí)，有時(shí)中間需要更新固定劑 （某些固定劑對組織的硬化作用較強(qiáng)），作用時(shí)間應(yīng)嚴(yán)加控制，不能過長，一般情況不超過24小時(shí)；5）一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合；6）固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，一般可用紗布包裹，系于細(xì)流水下沖洗10～15小時(shí)，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色；7）固定時(shí)間也因環(huán)境溫度而異，隨著溫度的增高可縮短固定時(shí)間。

表2 PCV-2 SD/2008株在組織器官中的檢出情況

表2 PCV-2 SD/2008株在組織器官中的檢出情況

表3 免疫組化陽性率檢測結(jié)果

表3 免疫組化陽性率檢測結(jié)果

脫水時(shí)采用逐級(jí)提高酒精濃度（70%→80%→90%→95%→100%）進(jìn)行樣本脫水，逐級(jí)提高酒精濃度脫水法可以預(yù)防組織過度收縮、變脆以及脫水不完全，另外注意脫水時(shí)間。

透明時(shí)透明劑選取的是二甲苯，二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯。

透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在30分鐘至2小時(shí)，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過3小時(shí)為宜。材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。

浸蠟時(shí)浸蠟要充分，時(shí)間為2～3小時(shí)。浸蠟的目的是讓石蠟替換組織中

脫水時(shí)采用逐級(jí)提高酒精濃度（70%→80%→90%→95%→100%）進(jìn)行樣本脫水，逐級(jí)提高酒精濃度脫水法可以預(yù)防組織過度收縮、變脆以及脫水不完全，另外注意脫水時(shí)間。

透明時(shí)透明劑選取的是二甲苯，二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久，容易收縮變脆變硬，同時(shí)若脫水不凈，就會(huì)引起不良后果，在應(yīng)用時(shí)必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進(jìn)入純二甲苯。

透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，—般各級(jí)停留時(shí)間在30分鐘至2小時(shí)，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過3小時(shí)為宜。材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。

浸蠟時(shí)浸蠟要充分，時(shí)間為2～3小時(shí)。浸蠟的目的是讓石蠟替換組織中的透明劑 （二甲苯），使石蠟填充整個(gè)組織塊。此步驟是在溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度調(diào)至60℃左右，恰好使石蠟溶解。浸蠟的時(shí)間和溫度是關(guān)鍵，浸蠟的溫度過高或時(shí)間過長，會(huì)使組織塊發(fā)生較大的收縮和脆變；如溫度低了或時(shí)間短了，石蠟將得不到充分的飽和，組織塊與石蠟結(jié)構(gòu)不嚴(yán)，將會(huì)給制片帶來許多困難。其中石蠟的質(zhì)量也很重要，鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24小時(shí)且無氣泡和不出現(xiàn)晶狀小點(diǎn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30分鐘 （注意別超過著火點(diǎn)），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除雜質(zhì)等顆粒。

包埋要快速認(rèn)真。包埋是指將組織埋入石蠟，凝固成塊。包埋之前應(yīng)將包埋皿與包埋鑷子一起放在溫箱中加熱。包埋時(shí)速度要快，防止包埋蠟與組織塊的溫度相差太大、蠟與組織塊結(jié)合不緊密而導(dǎo)致切片困難。的透明劑 （二甲苯），使石蠟填充整個(gè)組織塊。此步驟是在溫箱內(nèi)進(jìn)行，溫度調(diào)至60℃左右，恰好使石蠟溶解。浸蠟的時(shí)間和溫度是關(guān)鍵，浸蠟的溫度過高或時(shí)間過長，會(huì)使組織塊發(fā)生較大的收縮和脆變；如溫度低了或時(shí)間短了，石蠟將得不到充分的飽和，組織塊與石蠟結(jié)構(gòu)不嚴(yán)，將會(huì)給制片帶來許多困難。其中石蠟的質(zhì)量也很重要，鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30～35℃放置24小時(shí)且無氣泡和不出現(xiàn)晶狀小點(diǎn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細(xì)粒。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30分鐘 （注意別超過著火點(diǎn)），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除雜質(zhì)等顆粒。

包埋要快速認(rèn)真。包埋是指將組織埋入石蠟，凝固成塊。包埋之前應(yīng)將包埋皿與包埋鑷子一起放在溫箱中加熱。包埋時(shí)速度要快，防止包埋蠟與組織塊的溫度相差太大、蠟與組織塊結(jié)合不緊密而導(dǎo)致切片困難。

包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶，導(dǎo)致以后切片時(shí)引起碎裂。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修，便于切片。

切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，刀片鋒利對切片的完整很重要。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)擦凈。

切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。撈片時(shí)水浴溫度要控制好，溫度太高易導(dǎo)致組織片上的細(xì)胞組織間隙分散，溫度太低展片不充分，組織片易皺折。

烤片的溫度和時(shí)間很重要：溫度太高，時(shí)間太長，會(huì)造成對組織的損傷；溫度太低，時(shí)間不足，染色時(shí)易發(fā)生脫片或脫蠟不凈，切片著色淺，不上色或灰染。

實(shí)驗(yàn)用的載玻片必須潔凈，不能有油污 （檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。

4.2 免疫組化結(jié)果分析討論

PCV-2引起PMWS臨床癥狀和病變的嚴(yán)重程度與感染豬的年齡、感染病毒量及有無PCV-2抗體等因素有關(guān)。PCV-2能單獨(dú)引發(fā)PMWS，但單純用PCV-2很難復(fù)制出PMWS的典型臨床癥狀，只產(chǎn)生非典型的、輕微的或中等程度的臨床癥狀和病理損傷，如果要產(chǎn)生典型的PMWS癥狀必須與其它協(xié)同因子如PRRSV、PPV、PRV或豬肺炎支原體的共同感染才行。

本試驗(yàn)使用豬圓環(huán)病毒2型SD/ 2008株接種實(shí)驗(yàn)豬,復(fù)制出一些的PMWS臨床癥狀，如腹股溝淋巴結(jié)腫大；頜下淋巴結(jié)腫大壞死；脾臟大頭明

包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會(huì)產(chǎn)生結(jié)晶，導(dǎo)致以后切片時(shí)引起碎裂。包埋好的石蠟塊裝上切片機(jī)進(jìn)行切片前還須進(jìn)行固著和整修，便于切片。

切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，刀片鋒利對切片的完整很重要。切片完畢，應(yīng)及時(shí)用氯仿將切片機(jī)擦凈。

切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進(jìn)一步處理，但是切片常有細(xì)小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。撈片時(shí)水浴溫度要控制好，溫度太高易導(dǎo)致組織片上的細(xì)胞組織間隙分散，溫度太低展片不充分，組織片易皺折。

烤片的溫度和時(shí)間很重要：溫度太高，時(shí)間太長，會(huì)造成對組織的損傷；溫度太低，時(shí)間不足，染色時(shí)易發(fā)生脫片或脫蠟不凈，切片著色淺，不上色或灰染。

實(shí)驗(yàn)用的載玻片必須潔凈，不能有油污 （檢驗(yàn)法：已涂有粘片劑的載玻片上滴加數(shù)滴蒸餾水，若發(fā)現(xiàn)水不均勻分散而聚成滴狀，即表示載玻片不清潔，有殘留油脂等在上面）；切片的光面應(yīng)朝下，否則染色過程中切片容易脫落。

4.2 免疫組化結(jié)果分析討論

PCV-2引起PMWS臨床癥狀和病變的嚴(yán)重程度與感染豬的年齡、感染病毒量及有無PCV-2抗體等因素有關(guān)。PCV-2能單獨(dú)引發(fā)PMWS，但單純用PCV-2很難復(fù)制出PMWS的典型臨床癥狀，只產(chǎn)生非典型的、輕微的或中等程度的臨床癥狀和病理損傷，如果要產(chǎn)生典型的PMWS癥狀必須與其它協(xié)同因子如PRRSV、PPV、PRV或豬肺炎支原體的共同感染才行。

本試驗(yàn)使用豬圓環(huán)病毒2型SD/ 2008株接種實(shí)驗(yàn)豬,復(fù)制出一些的PMWS臨床癥狀，如腹股溝淋巴結(jié)腫大；頜下淋巴結(jié)腫大壞死；脾臟大頭明顯腫大，小頭呈鋸齒狀，大頭脾門淋巴結(jié)梗死；肺臟嚴(yán)重肉變，整肺呈花斑樣、淤血出血，右側(cè)隔葉灰黃色病灶，左側(cè)尖葉氣腫；肝臟有不同程度的虎斑狀病變；腎臟大部分呈黃色，皮質(zhì)出現(xiàn)大量米粒大的壞死灶。表明豬圓環(huán)病毒2型SD/2008株病毒確能造成豬體組織感染并引起病變。

陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞相應(yīng)的部位，不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會(huì)導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測抗原的不同，抗原分別定位在不同部位。組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現(xiàn)非特異性陽性反應(yīng)，要注意區(qū)分與鑒別。染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá)，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。

組織切片背景深與下列因素有關(guān)：石蠟切片脫蠟不干凈；第一抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長，溫度過高；顯色劑濃度過高；抗體不純等。

由于抗體的品種繁多，實(shí)驗(yàn)方法多種多樣，本實(shí)驗(yàn)室曾摸索過實(shí)驗(yàn)條件并予以運(yùn)用。

本研究使用免疫組化法檢測PCV-2病毒抗原，結(jié)果顯示：在頜下淋巴結(jié)、肺臟中，顯示強(qiáng)陽性信號(hào)；在肺泡、腹股溝淋巴結(jié)、肝臟中，顯示弱陽性；在腎臟中，陽性信號(hào)不明顯。對照組沒有檢測到陽性信號(hào)。

在各組織中，淋巴組織應(yīng)是該病毒的主要靶組織，被病毒感染的細(xì)胞也較多。在其它檢測到PCV-2病毒的組織中，感染細(xì)胞也基本為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。

綜上所述，本研究使用豬圓環(huán)病毒2型 PCV-2 SD/2008株系統(tǒng)研究了PCV-2人工感染豬體內(nèi)重要組織器官中病毒分布情況，為我國科研工作者研究PCV-2致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。