重癥甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的臨床意義探討

陳穎，王軍，溫華，代兵，孫龍鳳，譚偉，康健，趙洪文

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

重癥甲型H1N1流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化的臨床意義探討

陳穎，王軍，溫華，代兵，孫龍鳳，譚偉，康健，趙洪文

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，沈陽(yáng) 110001）

目的探討甲型H1N1流感（甲流）患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化及臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞儀對(duì)70例甲流患者，19例普通流感患者，31例健康體檢者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)。70例甲流患者中，男51例，女19例，年齡19～66歲。其中重癥24例，危重癥46例（死亡8例）。結(jié)果 普通流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群與健康對(duì)照組無(wú)差別，但甲流患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴數(shù)均明顯低于健康對(duì)照組和普通流感組（P均＜0.05）；危重癥甲流患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴數(shù)均分別明顯低于重癥甲流患者（P均＜0.01）；死亡患者外周血CD3、CD4、CD8T淋巴數(shù)均明顯低于存活患者（P均＜0.01），而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值；各組間CD4/CD8變化無(wú)顯著差別；甲流患者和健康對(duì)照者血中免疫球蛋白水平無(wú)差別。結(jié)論甲型H1N1流感病毒可能損傷細(xì)胞免疫，尤其是T細(xì)胞免疫，但未損傷體液免疫。外周血T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量減少可能是病情嚴(yán)重性和疾病轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，而且早期檢測(cè)對(duì)甲流與普通流感的鑒別可能有重要意義。

甲型H1N1流感；T淋巴細(xì)胞亞群；細(xì)胞免疫

2009年3 月以來(lái)，甲型H1N1流感（甲流）爆發(fā)并迅速在全球蔓延，我國(guó)也出現(xiàn)了大量的感染病例，且死亡病例迅速增加。由于本次甲型H1N1流感病毒是一種新型流感病毒，因此，許多臨床特點(diǎn)尚不清楚。為了觀察甲流患者免疫狀態(tài)的變化及其意義，本研究對(duì)70例重癥/危重癥甲流住院患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測(cè)，動(dòng)態(tài)觀察其變化，并與同期健康體檢者及普通流感患者進(jìn)行比較，以期發(fā)現(xiàn)重癥/危重癥甲流的某些特點(diǎn)，為臨床診斷、治療和估計(jì)預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源及分組

將研究對(duì)象分為：（1）甲型H1N1流感組（n=70）：2009年11月5日至2010年1月13日期間我院收治的經(jīng)咽拭子PCR檢測(cè)陽(yáng)性的臨床確診病例。男51例，女19例，平均年齡43歲（19～66歲）。其中入院時(shí)重癥甲流患者24例，危重癥甲流患者46例（死亡8例）。重癥和危重癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見(jiàn)衛(wèi)生部發(fā)布的《甲型H1N1流感診療方案（2009年第三版）》［1］；（2）普通流感組（n=19）：同期我院發(fā)熱門(mén)診普通流感患者；（3）健康對(duì)照組（n=31）：同期健康體檢者。

1.2 方法

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：（1）標(biāo)本處理：抽取患者外周血2ml，用肝素鈉抗凝管保存，6h內(nèi)分析。向TrueCount管內(nèi)分別加入20μl的抗體和50μl的抗凝全血，振蕩混勻3s，避光放置15min；加入1倍濃度的溶血素450μl，振蕩混勻后避光放置15min，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。（2）數(shù)據(jù)獲取與分析：使用CaliBRITE標(biāo)準(zhǔn)微球、FACSComp軟件調(diào)節(jié)FACS Calibur流式細(xì)胞儀PMT電壓、熒光補(bǔ)償、靈敏度，應(yīng)用MultiSet分析軟件對(duì)處理好的標(biāo)本進(jìn)行、絕對(duì)值計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外周血白細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)的比較

對(duì)所有住院甲流患者于入院次日晨抽外周血作血常規(guī)，并與健康對(duì)照組和同期我院發(fā)熱門(mén)診普通流感患者進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1各組研究對(duì)象的外周血白細(xì)胞總、分?jǐn)?shù)T a b.1P e r i p h e r a l WB Cc o u n t s a n d d i f f e r e n t i a l c o u n t s o f t h e s u b j e c t s i n e a c h g r o u p Group n WBC counts（×109/L） GRAN counts（×109/L） Lymphocyte counts（×109/L） NEUT（%） LYMPH（%）Normal subjects 31 6.20±1.39 3.62±1.18 2.06±0.68 85.55±15.35 32.63±10.56Seasonal influenza 19 6.48±3.10 4.67±2.54 1.62±1.10 87.67±7.40 22.65±8.401）Pandemic influenza 70 9.13±5.102） 7.42±5.102） 1.21±0.672） 76.29±15.352） 17.24±13.262）Severe cases 24 7.37±4.49 5.40±4.12 1.39±0.63 68.89±15.097 21.50±12.76Critical cases 46 10.05±5.213） 8.48±5.283） 1.12±0.68 80.01±14.333） 14.31±12.883）Survivals 62 8.67±6.54 6.19±3.68 1.26±0.67 73.98±14.10 18.88±13.21Deaths 8 18.28±4.874） 17.02±4.414） 0.88±0.57 93.38±2.824） 4.56±2.154）WBC，white blood cell；GRAN，granulocyte；NEUT，neutrophil；LYMPH，lymphocyte.1）P ＜ 0.05vs normal subjects；2）P ＜ 0.05vs normal subjects and seasonal influenza；3）P ＜ 0.05vs severe cases；4）P ＜ 0.05vs survivals.表2不同病情和轉(zhuǎn)歸的甲流患者外周血白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)T a b.2P e r i p h e r a l b l o o d WB Cc o u n t s a n d l y mp h o c y t e c o u n t s o f t h e H 1N 1p a t i e n t s w i t h d i f f e r e n t c o n d i t i o n a n d o u t c o me s Group n WBC counts>10×109/L（n/%） Lymphocyte counts<0.8×109/L（n/%）Pandemic influenza 70 22（31.4） 22（31.4）Severe cases 24 2（8.3） 6（25.0）Critical cases 46 20（43.4） 16（34.8）Survivals 62 14（22.6） 17（27.4）Deaths 8 8（100.0） 5（62.5）WBC，white blood cells.

結(jié)果顯示，除淋巴細(xì)胞比例降低外，普通流感患者較健康對(duì)照組白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、粒細(xì)胞計(jì)數(shù)均未見(jiàn)明顯異常。然而，甲流患者較正常人及普通流感患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞比例明顯降低，同時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，其中白細(xì)胞總數(shù)>10×109/L的甲流患者和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.8×109/L的甲流患者均占31.4%。將危重癥與重癥甲流相比較發(fā)現(xiàn)，危重癥甲流患者的白細(xì)胞總數(shù)和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)高于重癥患者，而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和比例低于重癥患者（危重癥和重癥患者細(xì)胞總數(shù)>10×109/L者分別占43.8%和8.3%，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.8×109/L分別占34.8%和25.0%），而且死亡患者白細(xì)胞總數(shù)和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)較存活甲流患者明顯升高，但淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和比例明顯降低（死亡患者和存活患者細(xì)胞總數(shù)>10×109/L者分別占100%和22.6%，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<0.8×109/L分別占62.5%和27.4%）。

2.2 各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

對(duì)所有住院甲流患者入院次日晨抽外周血作T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)，并與健康對(duì)照組和同期我院發(fā)熱門(mén)診普通流感患者進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3各組外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較（個(gè)/μl）T a b.3C o mp a r i s o n o f p e r i p h e r a l Tl y mp h o c y t e s u b s e t s o f t h e s u b j e c t s i n e a c h g r o u p Group n CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 Normal subjects 31 1322±493 727±258 550±256 1.45±0.52Seasonal influenza 19 1320±553 730±321 518±298 1.82±1.60Pandemic influenza 70 865±6501） 509±4031） 346±2591） 1.60±0.86Severe cases 24 1205±598 696±399 453±257 1.68±0.93Critical cases 46 687±6102） 412±3732） 290±2452） 1.55±0.82Survivals 62 971±638 554±406 375±260 1.61±0.89Deaths 8 291±1953） 165±1163） 116±823） 1.50±0.541）P＜0.05vs normal subjects and seasonal influenza；2）P＜ 0.01vs severe cases；3）P＜ 0.01vs survivals.表4不同病情和轉(zhuǎn)歸的甲流患者外周血淋巴細(xì)胞亞群低于正常低值的患者比例T a b.4T h e n u mb e r s o f H 1N 1p a t i e n t s w i t h p e r i p h e r a l b l o o d l y mp h o c y t e s u b s e t s b e l o wn o r ma l l o w e r l i mi t GroupnCD3<700/μl（n/%）CD4<400/μl（n/%）CD8<200/μl（n/%）Pandemic influenza 70 36（51.4） 36（51.4） 26（37.1）Severe cases 24 5（20.8） 6（25.0） 4（16.7）Critical cases 46 31（67.4） 30（65.2） 22（47.8）Survivals 62 28（45.2） 28（45.2） 19（30.6）Deaths 8 8（100.0） 8（100.0） 7（87.5）

與健康對(duì)照組比較，普通流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群未見(jiàn)降低，但甲流患者外周血的CD3、CD4、CD8均分別較健康對(duì)照組和普通流感組明顯降低（甲流患者外周血 CD3、CD4、CD8低于正常低值者分別占51.4%，51.4%和37.1%），而且隨著疾病嚴(yán)重性的加重其減低越明顯（表3）。將重癥甲流和危重癥甲流進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，危重癥甲流患者外周血CD3、CD4、CD8均分別明顯低于重癥甲流患者（P均＜0.01）。然而各組間CD4/CD8變化無(wú)顯著差別。將死亡患者與存活患者的外周血CD3、CD4、CD8進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，死亡患者均明顯低于存活患者，而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值（表4）。

2.3 急性期與恢復(fù)期甲流患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化

在70例甲流患者中，我們對(duì)20例患者進(jìn)行了外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，將急性期（入院時(shí)）與恢復(fù)期（出院時(shí)）外周血T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)期CD3、CD4、CD8［（1468±644）個(gè)/μl、（818± 375）個(gè)/μl、（594± 337）個(gè)/μl］比急性期 CD3［（470± 250）個(gè)/μl、（241± 147）個(gè)/μl、（200± 109）個(gè)/μl］明顯升高（P<0.01），基本恢復(fù)至正常水平。然而恢復(fù)期CD4/CD8（1.54±0.58）與急性期（1.31±0.56）相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。

2.4 甲流患者和健康對(duì)照者血中免疫球蛋白的變化

為了探索甲型H1N1流感病毒在損傷細(xì)胞免疫的同時(shí)是否也損傷體液免疫，我們對(duì)39例甲流患者及31例健康體檢者進(jìn)行了免疫球蛋白水平的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲流患者 IgA 、IgG 及 IgM［（2.235±1.04）g/L，（14.28±4.19）g/L，（1.2±0.6）g/L］與健康體檢者［（2.126±0.96）g/L，（12.84±3.23）g/L，（1.5±0.5）g/L］比較，未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

3 討論

2009年3 月以來(lái)爆發(fā)的甲型H1N1流感，是由一種以前未在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)過(guò)的A/H1N1流感病毒引起的急性熱性呼吸道傳染?。?］。研究表明，這種新型流感病毒基因組由禽流感、豬流感和人流感病毒基因混合而成，既有甲型流感病毒的共性，也有其特殊性［3］。甲型H1N1流感與季節(jié)性普通流感在致病性上有兩方面不同，一是大多數(shù)人僅有很弱或完全沒(méi)有對(duì)此病毒的既往獲得性免疫，二是這種病毒能夠累及下呼吸道并迅速引起進(jìn)行性肺炎［4］。

構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞主要有T、B淋巴細(xì)胞，機(jī)體對(duì)抗病毒感染主要是特異性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)［5，6］。人體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是由T淋巴細(xì)胞各亞群的比例來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)和維持的。因此甲流患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的研究對(duì)臨床診斷、治療和估計(jì)預(yù)后具有重要的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，普通流感患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群未見(jiàn)降低，說(shuō)明普通流感病毒對(duì)淋巴細(xì)胞亞群的損傷不明顯。但甲流患者外周血的CD3、CD4、CD8T淋巴細(xì)胞均較健康對(duì)照組和普通流感組明顯降低，而且隨著疾病嚴(yán)重性的加重其減低逐漸明顯。提示早期檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)甲流與普通流感的鑒別可能有重要意義，亦提示甲流患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群可能是病情嚴(yán)重性的一個(gè)重要指標(biāo)。將死亡患者與存活患者的外周血CD3、CD4、CD8T淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，死亡患者均明顯低于存活患者，而且死亡患者CD3和CD4均小于正常低值，提示甲流患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群可能是估計(jì)預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。我們對(duì)20例甲流患者的急性期和恢復(fù)期的外周血T淋巴細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)期CD3、CD4、CD8比急性期均明顯升高，且基本恢復(fù)至正常水平。也提示外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化對(duì)估計(jì)病情的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后具有重要的作用。但比較甲流患者與正常人的免疫球蛋白水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲流患者較正常人的IgA、IgG及 IgM未見(jiàn)明顯降低（P>0.05），這表明甲流病毒可能只損傷細(xì)胞免疫，而未損傷體液免疫。

本研究發(fā)現(xiàn)，普通流感患者較健康者除淋巴細(xì)胞比例降低外，余未見(jiàn)明顯異常，說(shuō)明普通流感病毒對(duì)淋巴細(xì)胞僅有輕微損害。然而，甲流患者較正常人及普通流感患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞比例明顯降低，同時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)及粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高；將危重癥與重癥甲流比較發(fā)現(xiàn)，危重癥甲流患者的白細(xì)胞總數(shù)和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于重癥患者，而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和比例明顯低于重癥患者，而且死亡與存活甲流患者比較結(jié)果顯示，白細(xì)胞總數(shù)和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，而淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和比例明顯降低。表明甲流病毒較普通流感病毒更易損傷淋巴細(xì)胞，其變化趨勢(shì)與T淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢(shì)相一致；而白細(xì)胞計(jì)數(shù)及粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高可能是由于細(xì)胞免疫的損傷繼發(fā)細(xì)菌感染所致。本組中8例死亡患者均合并繼發(fā)感染，其中2例血培養(yǎng)為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌敗血癥，2例血培養(yǎng)為鮑曼不動(dòng)敗血癥。國(guó)外研究也證明甲型H1N1流感易合并細(xì)菌性感染，尤其在重癥甲流的早期，病原菌以肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌最常見(jiàn)［7］。本結(jié)果提示甲流病毒損傷細(xì)胞免疫越重，越易引起細(xì)菌感染，外周血白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)的變化可能對(duì)判斷疾病的嚴(yán)重性和預(yù)后也具有一定的作用。

總之，本研究表明，甲型H1N1流感病毒可能只損傷細(xì)胞免疫，尤其是T細(xì)胞免疫，但未損傷體液免疫。而且，細(xì)胞免疫損傷越重，越易引起細(xì)菌感染，預(yù)后越差。因此，甲流患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群可能是病情嚴(yán)重性和疾病轉(zhuǎn)歸與預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)，早期檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)甲流與普通流感的鑒別可能也有著重要的臨床意義，而外周血白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)的變化可能對(duì)判斷疾病的嚴(yán)重性和預(yù)后具有一定的作用。

［1］衛(wèi)生部辦公廳.甲型H1N1流感診療方案（2009年第三版）［Z］.北京，2009.

［2］王新華，劉宇，周榮斌.甲型H1N1流感的研究現(xiàn)狀［J］.山東醫(yī)藥，2009，49（2）：107-108.

［3］李剛.甲型H1N1流感病毒的分子特征［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（3）：267-270.

［4］Clinical management of human infection with pandemic influenza（H1N1）2009：Revised guidance.World Health Organization，November，2009.

［5］Dunne PJ，F(xiàn)aint JM，Gudgeon NH，et al.Epstein-Barr virus-specific CD8（+）T cells that re-express CD45RA are apoptosis-resistant memory cells that retain replicative potential ［J］.Blood，2002，100（3）：933-940.

［6］Wills MR，Okecha G，Weekes MP，et al.Identification of naive or antigen-experienced human CD8（+）T cells by expression of costimulation and chemokinereceptors：analysisofthe human cytomegalovirus-specific CD8（+）T cell response ［J］.J Immunol，2002，168（11）：5455-5464.

［7］Centers for Disease Control and Prevention （CDC）.Bacterial coinfections in lung tissue specimens from fatal cases of 2009pandemic influenza A （H1N1）-United States，May-August 2009［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009，58（38）：1071-1074.

（編輯王又冬，英文編輯王又冬）

Clinical Significance of Peripheral Blood T-lymphocyte Subsets Changes in Pandemic Influenza （H1N1） Patients

CHEN Ying，WANG Jun，WEN Hua，DAI Bing，SUN Long-feng，TAN Wei，KANG Jian，ZHAO Hong-wen
（Department of Respiratory Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the change of peripheral blood T-lymphocyte subsets in pandemic influenza （H1N1）and its clinical significance.MethodsThe subsets of peripheral blood T-lymphocyte in 70patients with pandemic influenza（H1N1），19patients with seasonal influenza and 31normal subjects were detected by flow cytometry.The patients with pandemic influenza（H1N1）comprised of 51male and 19female aged 19to 66years，including 24severe cases and 46critical cases.ResultsThere was no significant difference in the numbers of peripheral blood T-lymphocyte subsets between the patients with seasonal influenza and normal subjects.However，the numbers of CD3，CD4and CD8lymphocytes significantly decreased in patients with pandemic influenza（H1N1）compared with those in seasonal influenza and normal subjects（P<0.05），especially in critical patients（P<0.01）.The counts in non-survivors decreased significantly compared with those in survivors（P<0.01），and both the counts of CD4and CD8in non-survivors were less than the normal lower limit.There was no significant change in CD4/CD8ratio among the three groups.IgA，IgM and IgG were not distinctive between the pandemic influenza（H1N1）patients and the normal subjects.ConclusionPandemic influenza （H1N1）might impair the cellular immunity，especially T-lymphocyte immunity，but not humoral immunity.The subsets of peripheral blood T lymphocyte might be an important index for the severity and prognosis of the disease.Early detection on them might have important significance for distinguishing pandemic influenza（H1N1）from seasonal influenza.

pandemic influenza（H1N1）；T-lymphocyte subsets；cellular immunity

R563.8

A

0258-4646（2011）02-0140-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0952.010

遼寧省醫(yī)學(xué)高峰建設(shè)工程重點(diǎn)科研項(xiàng)目（200922）

陳穎（1982-），女，醫(yī)師，本科.

趙洪文，E-mail：hwzhao2007@yahoo.com

2010-09-30