β-環(huán)糊精硝基衍生物HPLC柱分離手性藥物撲爾敏

沈靜茹，韋慧慰，余學(xué)紅，朱財(cái)延，毛 康

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074)

藥物撲爾敏大多以消旋體的形式出售，故撲爾敏(結(jié)構(gòu)式見圖1)的手性分離分析及制備研究對(duì)控制藥品質(zhì)量和各對(duì)映體潛在副作用的探究具有重要意義.目前，HPLC中撲爾敏手性分離主要通過營(yíng)造手性環(huán)境對(duì)其分離，如:采用羥丙基-β-環(huán)糊精作為流動(dòng)相添加劑，使得撲爾敏兩異構(gòu)體達(dá)到基線分離，分離度Rs＞2.99［1］.但此法所消耗手性選擇劑量遠(yuǎn)大于手性固定相法;通過右旋撲爾敏的分子印記聚合物作為固定相，在正相模式下使撲爾敏達(dá)到部分分離［2］;采用β-環(huán)糊精手性柱，質(zhì)譜檢測(cè)、分離人體血液中撲爾敏及其主要代謝物，最佳條件下?lián)錉柮魞僧悩?gòu)體之間分離度Rs達(dá)到1.17［3］等;通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制成固定相，在反相模式下手性分離血液中的撲爾敏及其主要代謝物［4］.上述手性固定相法均未使撲爾敏兩異構(gòu)體達(dá)到基線分離，本文通過實(shí)驗(yàn)室自制的雙［-6-氧-(-3-間硝基苯磺?；?丁二酸-1，4 單酯)-4-］-β-環(huán)糊精鍵合硅膠固定相HPLC柱，分別在正相和反相模式下分離撲爾敏消旋體，正相模式分離條件下最佳分離度Rs達(dá)到1.37;而反相模式下達(dá)到了基線分離，最佳分離度Rs為10.58.通過精密度試驗(yàn)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)考察分離分析方法.為進(jìn)一步制成制備柱，實(shí)現(xiàn)撲爾敏單一對(duì)映體的分離制備提供了條件.

圖1 撲爾敏結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of chlorpheniramine

1 主要儀器及試劑

1.1 試劑

異丙醇(色譜純，天津市科密毆化學(xué)試劑有限公司)、正己烷(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、三乙胺(分析純，上海金山亭化工試劑廠)、乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、雙［-6-氧-(-3-間硝基苯磺?；?丁二酸-1，4 單酯)-4-］-β-環(huán)糊精(β-CD-M2)(實(shí)驗(yàn)室自制)、超純水(美國(guó) Moleculer超純水機(jī)生產(chǎn))、馬來酸氯苯那敏標(biāo)樣(含量99.7%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、馬來酸氯苯那敏片(湖北華中藥業(yè)有限公司).

1.2 儀器

P230-Ⅱ高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)、pHS-3C型酸度計(jì)(上海偉業(yè)儀器廠)、0.22 μm微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠)、雙［-6-氧-(-3-間硝基苯磺?；?丁二酸-1，4 單酯)-4-］-β-環(huán)糊精鍵合硅膠固定相HPLC柱(β-CD-M2鍵合柱)(實(shí)驗(yàn)室自制)［5］.

1.3 色譜條件

色譜柱:β-CD-M2鍵合柱 4.6 mm ×150 mm(實(shí)驗(yàn)室自制);流動(dòng)相:正己烷-異丙醇、異丙醇-0.3%乙酸三乙胺(TEAA)緩沖溶液;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;柱溫:25℃;流速:正相體系為0.5 mL/min，反相體系為0.2 mL/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 正相模式下手性分離撲爾敏

在β-CD-M2鍵合柱上，以正己烷-異丙醇為流動(dòng)相，在異丙醇體積分?jǐn)?shù)為30% ～60%變化范圍內(nèi)對(duì)撲爾敏消旋體進(jìn)行手性分離，結(jié)果見表1.由表1可見，隨著流動(dòng)相中異丙醇體積分?jǐn)?shù)增加，保留時(shí)間減短.其主要原因?yàn)楫惐荚鰪?qiáng)了流動(dòng)相的極性，使溶劑與撲爾敏的相互作用增強(qiáng)，進(jìn)而增強(qiáng)了流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，當(dāng)異丙醇體積分?jǐn)?shù)為35% ～55%時(shí)撲爾敏兩手性異構(gòu)體保留時(shí)間有差異，實(shí)現(xiàn)了部分分離，最佳分離度Rs為1.37.

表1 正己烷-異丙醇為流動(dòng)相手性分離結(jié)果Tab.1 Result of chiral separation using hexane-isopropyl alcohol asmobile phase

選擇流動(dòng)相配比(V正己烷∶V異丙醇)分別為60%∶40%和55%∶45%時(shí)，所得的拆分結(jié)果見圖2.不同流動(dòng)相配比中，兩對(duì)映體的色譜峰(曲線a)均未被溶劑峰(曲線b)干擾.

2.2 反相模式下手性分離撲爾敏

2.2.1 流動(dòng)相異丙醇-0.3%TEAA配比對(duì)撲爾敏手性分離的影響

在β-CD-M2鍵合柱上，以異丙醇-0.3%TEAA(pH4.5)為流動(dòng)相，在異丙醇體積分?jǐn)?shù)為40% ～90%變化范圍內(nèi)對(duì)撲爾敏消旋體進(jìn)行手性分離，結(jié)果見表2.隨著流動(dòng)相中TEAA體積分?jǐn)?shù)的增大，分離度呈上升趨勢(shì);超過40%，分離度變化不明顯，而后峰的出峰時(shí)間延長(zhǎng).故在保證分離的情況下，為減短分析時(shí)間，選擇VTEAA∶V異丙醇=40%∶60%為最佳配比.

表2 流動(dòng)相中異丙醇-0.3%TEAA配比的影響Tab.2 Effect of the ratio of0.3%TEAA and isopropyl alcohol in themobile phase

圖2 正相模式下?lián)錉柮舻氖中苑蛛xFig.2 Chiral separation of chlorpheniramine at normal phasemodel

選擇流動(dòng)相異丙醇 －0.3%TEAA(pH4.5)，其體積配比為60%∶40%時(shí)所得的拆分結(jié)果見圖3.

圖3 溶劑為異丙醇-TEAA時(shí)撲爾敏在流動(dòng)相中的手性分離Fig.3 Chiral separation of chlorpheniramine using isopropyl alcohol-TEAA in themobile phase

2.2.2 流動(dòng)相中緩沖液pH值對(duì)撲爾敏手性分離的影響

在 β-CD-M2鍵合柱上，以V異丙醇∶V0.3%TEAA=60%:40%為流動(dòng)相，在緩沖液 pH分別為2.57、3.10、3.55、4.52、5.13、5.90、6.78 時(shí)進(jìn)行撲爾敏的手性分離，結(jié)果見圖4.

由圖4可知，隨著酸度的增加，分離度呈上升趨勢(shì)，pH 3.1 時(shí)最大，Rs=10.58;pH ＞3.0，分離度有所下降，但均Rs＞6.00，達(dá)到基線分離.撲爾敏兩對(duì)映體與固定相兩者均因有苯環(huán)而可形成π-π共軛，均含有易產(chǎn)生氫鍵的元素(N、O元素等)，且撲爾敏pKa=9.2［6］，達(dá)到基線分離 pH 值范圍(2.5 ～6.7)撲爾敏兩異構(gòu)體帶電，故兩對(duì)映體與固定相易形成分子間作用力(如氫鍵或靜電作用等)，且因作用力強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致兩對(duì)映體與固定相的結(jié)合力有所差異，因而保留時(shí)間相距甚遠(yuǎn)，分離度大.

圖4 緩沖液酸度對(duì)撲爾敏手性分離的影響Fig.4 Effect of buffer acidity

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 考察分離的線性范圍

配置撲爾敏標(biāo)準(zhǔn)品(99.7%)溶液，濃度分別為:0.055、0.137、0.273、0.342、0.687、1.367 mg/mL.以β-CD-M2鍵合硅膠為固定相，室溫流動(dòng)相流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量20μL，測(cè)定撲爾敏分離的線性范圍，分別考察了峰高-濃度、峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線.前鋒峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1124.7691X，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9985，峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=84258.63998X，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9998;后峰峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1122.59395X，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9985，峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=84237.81861X，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9998.

2.3.2 精密度考察

在β-CD-M2鍵合硅膠為固定相，室溫，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量20 μL 色譜條件下測(cè)定 0.137 mg/mL撲爾敏中2組份的精密度，進(jìn)樣次數(shù)n=12，得精密度考察結(jié)果:前峰峰高相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.77%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.05%;后峰峰高相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.90%，峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.15%.

2.3.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

色譜條件:β-CD-M2鍵合硅膠為固定相，室溫，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量20 μL.在0.20 mg/mL 撲爾敏樣品中分別測(cè)定加入濃度為 0.16、0.20、0.24 mg/mL撲爾敏標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算加標(biāo)回收率.測(cè)定次數(shù)n=4，測(cè)定結(jié)果見表3.

表3 撲爾敏加標(biāo)回收率(n=4)Tab.3 Percent recovery of chlorpheniramine

由表3可知，加標(biāo)濃度為0.16 mg/mL時(shí)，以峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為86.14% ～90.68%，以峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為90.90%～95.77%;加標(biāo)濃度為0.20 mg/mL 時(shí)，以峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為94.69% ～106.93%，以峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為86.36% ～89.14%;加標(biāo)濃度為 0.24 mg/mL 時(shí)，以峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為105.41% ～108.76%，以峰面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算回收率為 89.15%～91.01%.

說明加標(biāo)濃度與樣品濃度相當(dāng)時(shí)用峰高定量此法的準(zhǔn)確度較高(回收率為94.69% ～106.93%)，低于或高于樣品濃度20%測(cè)定值會(huì)略有偏低或偏高的現(xiàn)象.

3 結(jié)語

以實(shí)驗(yàn)室自制的雙［-6-氧-(-3-間硝基苯磺酰基-丁二酸-1，4 單酯)-4-］-β-環(huán)糊精鍵合全多孔硅膠固定相分別在正相和反相模式下進(jìn)行了手性藥物撲爾敏的分離研究.建立了手性藥物撲爾敏拆分的高效液相色譜檢測(cè)方法.在正相最佳條件下分離度Rs為1.37;反相最佳條件下分離度Rs達(dá)10.58.考察了流動(dòng)相配比、pH值對(duì)分離效果的影響.確定在反相模式下?lián)錉柮魸舛葹?.000～1.367 mg/mL范圍內(nèi)，峰高、峰面積與濃度呈線性關(guān)系.通過精密度試驗(yàn)考察，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=12)均小于4%.加標(biāo)回收率為86.14% ～108.76%.加標(biāo)濃度為0.20 mg/mL時(shí)，以峰高-濃度曲線計(jì)算，回收率為94.69% ～106.93%.

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